Държавен вестник, брой 7 от 23.I

Параграф единствен. В приложение № 6 към чл. 16 накрая се добавя:

"ХLIХ. Определяне на натриев лазалоцид

Натриева сол на полиетерната монокарбоксилна киселина, получена от Streptomyces lasaliensis

1. Цел и обхват

С този метод се определя съдържанието на натриев лазалоцид в храните за животни и премиксите. Границата на откриване е 5 mg/kg, а границата на определяне е 30 mg/kg.

2. Принцип

Натриев лазалоцид се извлича от проба в подкислен метанол и се определя чрез високо-ефективна течна хроматография (HPLC) с обратна фаза, с помощта на спектрофлуориметричен детектор.

3. Реактиви

3.1. Калиев дихидрогенфосфат (КН2РО4)

3.2. Ортофосфорна киселина, w = 85 %

3.3. Разтвор на ортофосфорна киселина,

s = 20 %

Разредете 23,5 ml ортофосфорна киселина (3.2) до 100 ml с вода.

3.4. 6-Метил-2-хептиламин (1,5-диметилхексиламин), w = 99 %

3.5. Метанол, клас HPLC

3.6. Солна киселина, r20 1,19 g/ml

3.7. Буферен разтвор на фосфат, с = 0,01 mol/l

Разтворете 1,36 g от КН2РО4 (3.1) в 500 ml вода (3.11), добавете 3,5 ml ортофосфорна киселина (3.2) и 10,0 ml 6-метил-2-хептиламин (3.4). Прибавете разтвор на ортофосфорна киселина (3.3) до получаване на рН 4,0 и разредете до 1000 ml с вода (3.11).

3.8. Подкислен метанол

Прехвърлете 5,0 ml солна киселина (3.6) в 1000 милилитрова мерителна колба, допълнете с метанол (3.5) до маркировката и разбъркайте. Разтворът трябва да бъде прясно приготвен преди употреба.

3.9. HPLC мобилна фаза, фосфато буферен метанолен разтвор 5 + 95 (V + V)

Смесете 5 ml от фосфатния буферен разтвор (3.7) с 95 ml метанол (3.5).

3.10. Стандартна субстанция на натриев лазалоцид с гарантирана чистота, C14H53O8Na (натриева сол на полиетерната монокарбоксилна киселина, получена от Streptomyces lasaliensis), Е763

3.10.1. Основен стандартен разтвор на натриев лазалоцид, 500 µg/ml

Претеглете с точност до 0,1 mg и поставете 50 mg натриев лазалоцид (3.10) в мерителна колба от 100 ml, разтворете в подкислен метанол (3.8), допълнете със същия разтворител до маркировката и разбъркайте. Разтворът трябва да бъде прясно приготвен преди употреба.

3.10.2. Междинен стандартен разтвор на натриев лазалоцид, 50 µg/ml

Отмерете с пипета 10,0 ml от основния стандартен разтвор (3.10.1) в мерителна колба от 100 ml, допълнете с подкислен метанол (3.8) до маркировката и разбъркайте. Разтворът трябва да бъде прясно приготвен преди употреба.

3.10.3. Калибрационни разтвори

Прехвърлете съответно 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 и 10,0 ml от междинния стандартен разтвор (3.10.2) в серия от 50-милилитрови градуирани колби. Допълнете с подкислен метанол (3.8) до маркировката и разбъркайте. Тези разтвори отговарят съответно на 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 и 10,0 µg натриев лазалоцид на ml. Разтворите трябва да бъдат прясно приготвени преди употреба.

3.11. Вода, клас HPLC

4. Апаратура

4.1. Ултразвукова вана (или вибрираща водна баня) с регулиране на температурата

4.2. Мембранни филтри, 0,45 µm

4.3. Оборудване за HPLC с инжекционна система, подходяща за инжектиране на обеми от 20 µl.

4.3.1. Колона за течен хроматографски анализ 125 mm x 4 mm, обратна фаза С18, опаковка 5 µm или еквивалент

4.3.2. Спектрофлуориметър с регулиране за промяна на дължините на вълните при възбуждане и емисия

5. Процедура

5.1. Общо описание

5.1.1. Празна проба храна за животни

За изпълнението на теста за извличане (5.1.2) следва да се анализира проба храна за животни, за да се провери за наличие на натриев лазалоцид и пречещи субстанции. Храната за животни от пробата трябва да е подобен по вид на този от изследваната проба и в него не трябва да се открива наличие на натриев лазалоцид или пречещи субстанции.

5.1.2. Тест за извличане

Тестът за извличане се извършва, като се анализира пробата храна за животни, обогатена чрез прибавяне на такова количество натриев лазалоцид, близко до наличното в пробата. За да обогатите при ниво 100 mg/kg, пресипете 10,0 ml от основния стандартен разтвор (3.10.1) в конична колба от 250 ml и изпарете разтвора, докато получите приблизително 0,5 ml. Добавете 50 g проба храна за животни, смесете добре и оставете да престои 10 минути. Разбъркайте отново няколко пъти, преди да преминете към екстракцията (5.2).

Като алтернатива, ако не разполагате с храна за животни за проба, подобен по вид на този от изследваната проба (виж 5.1.1), тестът за извличане може да се извърши чрез стандартен метод на добавяне. В този случай пробата, която ще се анализира, се обогатява с такова количество натриев лазалоцид, което е близко до наличното в пробата. Тази проба се анализира заедно с необогатената проба, като извличането се калкулира чрез изваждане.

5.2. Екстракция

5.2.1. Храни за животни

Претеглете с точност до 0,01 g и поставете от 5 g до 10 g от пробата в 250-милилитрова конична колба с тапа. Прибавете с пипета 100,0 ml подкислен метанол (3.8). Запушете леко с тапата и разклатете, за да може съдържанието да се диспергира. Поставете колбата в ултразвукова вана (4.1) при температура приблизително 40 °С за 20 минути, след което я отместете и охладете до стайна температура. Оставете да престои около 1 час, докато суспензията се утаи, след което филтрирайте в подходящ съд една аликвотна част през мембранен филтър 0,45 µm (4.2). Пристъпете към определяне чрез HPLC (5.3).

5.2.2. Премикси

Претеглете с точност до 0,001 g и поставете около 2 g несмлян премикс в мерителна колба от 250 ml. Прибавете 100,0 ml подкислен метанол (3.8) и разклатете, за да може съдържанието да се диспергира. Поставете колбата със съдържанието в нея в ултразвукова вана (4.1) при температура приблизително 40 °С за 20 минути, след което отместете и охладете до стайна температура. Разредете с подкислен метанол (3.8) до маркировката и смесете добре. Оставете да престои около 1 час, докато суспензията се утаи, след което филтрирайте една аликвотна част през мембранен филтър 0,45 µm (4.2). Разредете подходящ обем от чистия филтрат с подкислен метанол (3.8), за да получите окончателен разтвор за тестване, който съдържа около 4 µg/ml натриев лазалоцид. Пристъпете към определяне чрез HPLC (5.3).

5.3. Определяне чрез HPLC

5.3.1. Параметри

Следните условия се посочват като указващи; може да се използват други, при условие че дават равностойни резултати:

Колона за течен хро-	125 mm x 4 mm, обрат-
матографски анализ	на фаза С18, опаковка
(4.3.1):	5 µm или еквивалент
Мобилна фаза (3.9):	Смес на фосфатен
	буферен разтвор (3.7)
	и метанол (3.5),
	5 + 95 (V +V)
Скорост на пропускане:	1,2 ml/min
Дължина на детекция:
- Възбуждане:	310 nm
- Емисия:	419 nm
Инжекционен обем:	20 µl

Проверете стабилността на хроматографската система, като инжектирате няколко пъти калибрационен разтвор (3.10.3), съдържащ 4,0 µg/ml, докато бъдат постигнати постоянни пикови височини (или площи) и времена на задържане.

5.3.2. Калибрираща графика

Инжектирайте от всеки калибрационен разтвор (3.10.3) по няколко пъти и определете средните пикови височини (площи) за всяка концентрация. Начертайте калибрираща графика, като използвате средните пикови височини (площи) за ординати, а съответстващите концентрации - за абсциси

5.3.3. Разтвор на пробата

Инжектирайте няколко пъти получените в 5.2.1 или 5.2.2 екстракти от изследваната проба, като използвате същия обем, взет при калибрационния разтвор, и определете средните пикови височини (площи) на пиковете на натриевия лазалоцид.

6. Изчисление на резултатите

От средната пикова височина (площ), получена чрез инжектиране на разтвора на пробата (5.3.3), определете концентрацията на натриев лазалоцид (µg/ml) по калибриращата графика.

6.1. Храни за животни

Съдържанието на натриев лазалоцид,

w (mg/kg) в пробата се изразява със следната формула:

b = концентрацията на натриев лазалоцид в разтвора на пробата (5.2.1) в µg/ml;

V1 = обем на екстракта от пробата, съгласно 5.2.1 в ml (т.е. 100);

m = масата в g на взетата за анализ част.

6.2. Премикси

Съдържанието на натриев лазалоцид w (mg/kg) в пробата се изразява със следната формула:

b = концентрацията на натриев лазалоцид в разтвора на пробата (5.2.2) в µg/ml;

V2 = обем на екстракта от пробата, съгласно 5.2.2 в ml (т.е. 250);

f = фактор на разреждане, съгласно 5.2.2;

m = масата в g на взетата за анализ част.

7. Потвърждаване на резултатите

7.1. Идентичност

Методите, които са базирани на спектрофлуориметрията, са в по-малка степен подложени на смущения, отколкото тези, при които се използва UV детекция. Идентичността на анализа може да се потвърди чрез ко-хроматография.

7.1.1. Ко-хроматография

Обогатява се екстракт от пробата (5.2.1 или 5.2.2), като се добави подходящо количество калибрационен разтвор (3.10.3). Количеството добавен натриев лазалоцид трябва да бъде близко до това, открито в екстракта от пробата. На базата на добавеното количество натриев лазалоцид и разреждането на екстракта следва да се увеличи само височината на пика на натриевия лазалоцид. Широчината на пика при половин височина трябва да бъде в границите на ± 10 % от оригиналната широчина на пика, получен при необогатения екстракт от пробата.

7.2. Повторяемост

Разликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени върху същата проба, не трябва да превишава:

- 15 % спрямо по-високата стойност при съдържание на натриев лазалоцид от 30 до 100 mg/kg;

- 15 mg/kg при съдържание на натриев лазалоцид от 100 до 200 mg/kg;

- 7,5 % спрямо по-високата стойност при съдържание на натриев лазалоцид над 200 mg/kg.

7.3. Извличане

При обогатената проба храна за животни извличането трябва да бъде най-малко 80 %. При обогатените проби премикси извличането трябва да бъде най-малко 90 %.

8. Резултати от паралелно изследване

Проведено беше паралелно изследване (Analyst, 1995, 120, 2175-2180.) , при което бяха анализирани 2 премикса (проби 1 и 2) и 5 храна за животни (проби 3 - 7) от 12 лаборатории. Върху всяка проба беше извършен двоен анализ. Резултатите са представени в следната таблица:

	Проба 1	Проба 2	Проба 3	Проба 4	Проба 5	Проба 6	Проба 7
	Пилета	Пуйки	Пуйки	Пилета	Пуйки	Домашни	Домашни
	Премикс	Премикс	Гранулиран	Натрошен	Храна за	птици	птици
					животни	Храна за	Храна за
						животни А	животни В
L	12	12	12	12	12	12	12
N	23	23	23	23	23	23	23
Средно (mg/kg)	5050	16 200	76,5	78,4	92,9	48,3	32,6
Sr (mg/kg)	107	408	1,71	2,23	2,27	1,93	1,75
Cvr (%)	2,12	2,52	2,24	2,84	2,44	4,00	5,37
SR (mg/kg)	286	883	3,85	7,32	5,29	3,47	3,49
CVR (%)	5,66	5,45	5,03	9,34	5,69	7,18	10,70
Номинално съдържание (mg/kg)	5000*	16 000*	80*	105*	120*	50+	35+

L = брой лаборатории

N = брой на отделните резултати

Sr = стандартно отклонение на повторяемостта

SR = стандартно отклонение на възпроизводимостта

Cvr = коефициент на изменение на повторяемостта, %

CVR = коефициент на изменение на възпроизводимостта, %

* съдържание, декларирано от производителя

+ храна, приготвена в лабораторията

L. Условия, които се прилагат при откриването, определянето или оценката на съставките от животински произход в храните за животни чрез микроскопски анализ

1. Цели и поле на приложение

Настоящите условия се прилагат при откриването чрез микроскопски анализ на съставки от животински произход (определени като преработени продукти от трупове или части от бозайници, птици и риби) в храните за животни в рамките на програмата за координиран контрол в областта на храненето на животните съгласно Директива 95/53/ЕО на Съвета. Предвижда се, че методите, описани в настоящото приложение, се използват при всички официални изпитвания, може да бъде извършено и второ изпитване по производни или друг вид методи с цел усъвършенстване на откриването на някои типове съставки от животински произход или за определяне с по-голяма точност на произхода на съставките. Освен това за анализа на някои специфични съставки от животински произход, като плазмата или костите в салото (вж. също точка 9), може да се използва и различен протокол, при условие че тези анализи се провеждат в допълнение на анализите, предвидени в програмата за координирания контрол.

2. Чувствителност

В зависимост от естеството на съставките от животински произход много малки количества могат да бъдат откривани в храните за животни (< 0,1 %).

3. Принцип

За определянето се използва представителна проба, взета съгласно разпоредбите, определени в Директива 76/371/ЕИО на Комисията от 1 март 1976 г. относно определянето на методите на Общността за взимане на проби и за официалния контрол върху храните за животни (ОВ L 102, 15.4.1976 г., стр. 1.), пробата е надлежно подготвена за целта. Съставя се следният протокол за третирането на храни за животни с ниска влажност. Храните за животни с влажност над 14 % се изсушават (кондензират) преди третирането им. Някои храни за животни или някои суровини, предназначени за храни на животни (например мас и масла), изискват специално третиране (вж. точка 9). Съставките от животински произход се определят на базата на типични характеристики, които се установяват под микроскоп (а именно мускулни влакна и други части от месо, хрущяли, кости, рога, косми, четина, кръв, пера, черупки от яйца, рибешки кости, люспи). Идентификацията се отнася както за пресятата фракция (6.1), така и за концентрираната утайка (6.2) на образеца.

4. Реактиви

4.1 Фиксатори

4.1.1. Хлоралхидрат (водонаситен до 60 % об. тегло)

4.1.2. Основа (2,5 % об. тегло NaOH или 2,5 % об. тегло KOH) за пресетите фракции

4.1.3. Парафиново масло или глицерол (вискозитет: 68-81) за микроскопски анализ на утайка

4.2. Промиващи средства

4.2.1. Спирт, 96 %

4.2.2. Ацетон

4.3. Концентриращи реактиви

4.3.1. Тетрахлоретилен (плътност 1,62)

4.4. Оцветяващ реагент

4.4.1. Йодиран разтвор/калиев йодид (да се разтворят 2 g калиев йодид в 100 ml вода и да се прибави 1 g йод, да се разклаща често)

4.4.2. Ализариново червено (да се разтворят 2,5 ml солна киселина 1М в 100 ml вода и към този разтвор да се прибавят 200 g ализариново червено)

4.4.3. Цистинов реактив (2 g оловен ацетат, 10 g NaOH на 100 ml Н2О)

4.4.4. Йодиран разтвор калиев йодид (етанол 70 % р-р)

4.5. Избелващ реагент

4.5.1. Готов разтвор на натриев хидрохлорид (9,6 % активен хлор)

5. Апаратура и помощни средства

5.1. Лабораторна везна (точност от 0,01 g, с изключение на концентрираната утайка: 0,001 g)

5.2. Инструмент за стриване (мелничка или хаванче, по-конкретно за животински продукти с мастно съдържание над 15 % към момента на анализа)

5.3. Сито с квадратни отвори с размер на отвора максимум 0,50 mm

5.4. Декантационна колба или бехерова чаша с конично дъно

5.5. Стереомикроскоп (увеличение най-малко 40 пъти)

5.6. Съставен микроскоп (увеличение най-малко 400 пъти) с излъчена или поляризирана светлина.

5.7. Стандартна лабораторна стъклария

Цялото оборудване се почиства старателно. Декантационните колби и стъклария трябва да се измият машинно. Ситата се почистват с помощта на четка с твърд косъм.

6. Процедура

Гранулираните храни могат да бъдат предварително пресети, ако двете фракции се анализират като отделни образци.

Третират се най-малко 50 g от пробата (стрити старателно, ако е необходимо, с помощта на подходящ инструмент за смилане (5.2) с цел да се получи подходяща структура). От смления материал се вземат две представителни дози, едната за пресятата фракция (най-малко 5 g) (6.1), другата за концентрираната утайка (най-малко 5 g) (6.2). Оцветяването с реагенти (6.3) може да бъде използвано и за идентификационни цели.

С цел да бъде показан видът на животинските протеини и произходът на частиците може да се използва помощно решаващо устройство, като например ARIES, както и еталонни проби.

6.1. Определяне на съставки от животински произход в пресетите фракции

Най-малко 5 g от пробата трябва да се пресеят (5.3) в две фракции.

Пресятата/тите фракция/и, съдържаща/и едрите частици (или представителна част от фракцията), се разстила върху съответния носител, така че да образува фин слой и методично се изследва под стереомикроскоп (5.5) при различни увеличения за откриване на съставките от животински произход.

Предметните стъкла с препаратите на пресятата/ите фракция/и, които съдържат фини частици, се изследват методично под съставен микроскоп (5.6) при различни увеличения за откриване на съставките от животински произход.

6.2. Определяне на съставки от животински произход в концентрираната утайка

Най-малко 5 g (точност от 0,01 g) от пробата се пресипват в декантационна колба или бехерова чаша с конично дъно и се обработват с най-малко 50 ml тетрахлоретилен (4.3.1). Сместа се разклаща или разбърква неколкократно.

- Ако се използва затворена декантационна колба, сместа трябва да се остави да престои достатъчно дълго време, преди да се утаи (минимум три минути) и да се отдели утайката. Неколкократно се разклаща и се оставя отново да се утаи за минимум три минути, преди да се отдели отново утайката.

- Ако се използва отворена бехерова чаша, сместа трябва да се остави да се утаи минимум 5 минути преди да се отдели утайката.

Цялата утайка се изсушава и след това се претегля (точност от 0,001 g). Не се налага теглене, освен ако не се изисква количествена оценка. Ако утайката се състои от много едри частици, може да се пресее (5.3) в две фракции. Изсушената утайка се изследва със стереомикроскоп (5.5) и със съставен микроскоп (5.6) за установяване на съставки от кости.

6.3. Използване на фиксатори и оцветяващ реагент

Идентифицирането чрез микроскоп на съставките от животински произход може да се улесни чрез използването на специални фиксатори и оцветители.

Хлорал хидрат (4.1.1): Чрез внимателно затопляне клетъчните структури могат да бъдат виждани по-ясно, тъй като зърната нишесте желатинизират и нежеланото клетъчно съдържание се отстранява.

Луга (4.1.2): Както натриевият хлорид, така и калиевият хлорид изчистват изследвания материал, като подпомагат откриването на мускулни влакна, косми и други кератинови структури.

Парафиново масло и глицерол (4.1.3): Костните съставки могат да бъдат добре идентифицирани в този запечатващ агент, тъй като повечето кухини остават запълнени с въздух и се появяват като черни дупки с размери около 5 - 15 µm.

Йодин/разтвор от калиев йодид (4.4.1): Използван за откриване на нишесте (синьо-виолетов цвят) и протеини (жълто-оранжев цвят). Разтворите могат да бъдат разредени, ако е необходимо.

Червен разтвор на ализарин (4.4.2): Червено/розово оцветяване на кости, кости от риба и люспи. Преди изсушаване на утайката (виж раздел 6.2) цялата утайка се прехвърля в стъклена епруветка и се изплаква два пъти с приблизително 5 ml алкохол (4.2.1) (всеки път следва да се използва вортекс миксер, разтворителят се оставя да действа около една минута и се излива). Преди да се използва този оцветител, утайката се избелва, като се добавя най-малко 1 ml натриев хипохлоритен разтвор (4.5.1). Реакцията се оставя да продължи 10 минути. Епруветката се напълва с вода, утайката се оставя от две до три минути и водата и частиците, които са в състояние на суспензия, се изливат. Утайката се изплаква още два пъти с около 10 ml вода (следва да се използва вортекс миксер, оставя се да се утаи и водата се излива всеки път). Добавят се от 2 до 10 или повече капки (в зависимост от количеството на утайката) червен разтвор на ализарин. Сместа се разклаща и реакцията се осъществява за няколко секунди. Оцветената утайка се изплаква два пъти с приблизително 5 ml алкохол (4.2.1), последвани от едно изплакване с ацетон (4.2.2) (всеки път следва да се използва вортекс миксер, разтворът се оставя да се утаи за около една минута и течността се излива). След това утайката е готова за изсушаване.

Реагент за цистин (4.4.3): Чрез внимателно загряване съставките, съдържащи цистин (козина, пера и т. н.), стават черно-кафяви.

6.4. Изследване на храните за животни, които биха могли да съдържат рибни брашна

Под съставен микроскоп се изследва минимум едно предметно стъкло с препарат от пресята фина фракция и от фина фракция на утайка (виж раздели 6.1 и 6.2).

Ако на етикета е посочено наличие на рибни брашна в съставките или ако има съмнение, или бъде открито наличие на рибни брашна при първоначалния преглед, се изследват най-малко две допълнителни предметни стъкла с препарати от пресята фина фракция на оригиналната проба и на фракция от общата утайка.

7. Изчисляване и оценка

Държавите членки гарантират спазването на процедурите, описани по-нататък, при всеки официален анализ, целящ количествена оценка (не само наличие) на съставки от животински произход.

Изчислението може да бъде направено само ако съставките от животински произход включват парчета от кости.

Парчетата от кости от сухоземни топлокръвни видове животни (т.е. бозайниците и птиците) се различат от различните типове рибни кости върху микроскопско предметно стъкло по типичните лакуни (вдлъбнатини). Съотношението на отделните съставки от животински произход в пробата се изчислява, като се отчита:

- разчетното съотношение (теглови проценти) на костите в съставките от животински произход и

- пропорцията (теглови проценти) на костите в съставките от животински произход.

Оценката трябва да се базира на изследването на най-малко три предметни стъкла (ако е възможно) и на най-малко пет полета за стъкло. В комбинираните храни за животни концентрираната утайка съдържа не само парчета от кости на сухоземни животни и рибни кости, но и други частици с високо специфично тегло, например минерали, пясък, части от вдървесени растения и др.

7.1. Разчетната стойност на процентното съдържание на парчета от кости

Процентно съдържание на парчета кости от сухоземни видове = (S x c)/W

Процентно съдържание на парчета от рибни кости и люспи = (S x d)/W

(S = маса на утайката (mg), с = корекционен коефициент (%) за разглежданата доза кости от сухоземни животни в утайката, d = корекционен коефициент за разглежданата доза парчета от рибни кости и люспи в утайката, W = тегло на образеца, от който произлиза утайката (mg).

7.2. Разчетната стойност на съставките от животински произход

Пропорционалното участие на кости в продуктите от животински произход може да варира значително. (Процентното съдържание на кости е от порядъка на 50 до 60 % за костните брашна и от порядъка на 20 до 30 % за месните брашна; в случаите с рибени брашна съдържанието на кости и люспи варира в зависимост от категорията и произхода на рибеното брашно, но е в рамките обикновено на 10 до 20 %.)

Ако се знае съдържанието на този тип брашно в пробата, възможно е да се направят следните оценки:

Разчетно съотношение на производните съставки от продукти на животинска основа от сухоземни животни (%) = (S x c)/(W x f) x 100

Разчетно съотношение на производните съставки от продукти на рибена основа (%) = =(S x d)/(W x f) x 100

(S = маса на утайката (mg), с = корективен коефициент (%) за разглежданата доза кости от сухоземни животни в утайката, d = корективен коефициент за разглежданата доза парчета от рибни кости и люспи в утайката, f = корективен коефициент за съдържанието на кости в съставките от животински произход в разглеждания образец, W = тегло на образеца, от който произлиза утайката (mg).

8. Излагане на резултата от изследването

Отчетът съдържа най-малко информация относно наличието на съставки, производни от сухоземни животни и рибени брашна. Отделните случаи се представят по следния начин:

8.1. Що се отнася до наличието на съставки, производни от сухоземни животни:

- в разглежданата проба не се откриват съставки, производни на сухоземни животни, доколкото могат да бъдат видени под микроскоп,

или:

- в разглежданата проба се откриват съставки, производни на сухоземни животни, доколкото могат да бъдат видени под микроскоп.

8.2. Що се отнася до наличието на рибени брашна:

- в разглежданата проба не се откриват съставки, производни на риба, доколкото могат да бъдат видени под микроскоп,

или:

- в разглежданата проба се откриват съставки, производни на риба, доколкото могат да бъдат видени под микроскоп.

Ако бъдат открити съставки, производни от риба или сухоземни животни, при необходимост отчетът от изследванията може да дава количествена оценка на откритите съставки (х %, < 0,1 %, между 0,1 и 0,5 %, между 0,5 и 5 % или > 5 %) и да уточнява типа сухоземни животни (ако е необходимо) и идентифицираните съставки от животински произход (мускулни влакна, хрущяли, кости, рога, косми, четина, кръв, пера, яйчни черупки, кости от риба, люспи).

Ако се прави количествена оценка на съставките от животински произход, то използваният корективен коефициент f също се упоменава.

Когато се установи наличието на кости от сухоземни животни, в отчета се добавя и следната клауза:

"Не се изключва възможността гореизброените съставки да произхождат от бозайници".

Тази допълнителна клауза не се изисква, ако парчетата кости на сухоземни животни са идентифицирани като парчета кости на птици или бозайници.

9. Незадължителен протокол от анализа на мас или масла

При анализа на мас и масла може да се използва следният протокол:

- За твърдата мас: тя трябва да се загрее до втечняването й, например в микровълнова печка.

- Да се вземат с пипета 40 ml масти от дъното на пробата и да се накапят в центрофуга.

- Да се центрофугира за 10 минути при 4000 оборота/минута.

- Ако маста се втвърди при центрофугирането, да се загрее в печката, докато пак се върне в течно състояние. Да се центрофугира отново за 5 минути при 4000 оборота/минута.

- С малка лъжичка или с шпатула половината от получените примеси се прехвърлят в малка чашка на Петри или върху микроскопско предметно стъкло с цел да се открие под микроскоп евентуалното наличие на съставки от животински произход (мускулни влакна, пера, парчета от кости и др.). Препоръчително е използването на парафиново олио или глицерол като запечатващ агент (фиксатор) за микроскопския анализ.

- Остатъчните примеси се използват за подготвянето на утайката по начина, описан в точка 6.2.

LI. Определяне съдържанието на спирамицин чрез дифузия в хранителна среда агар-агар

1. Цел и обхват

Методът се използва за определяне съдържанието на спирамицин в храните за животни и предварително приготвените смеси. Долната граница на определяне е 1 mg/kg (1ррm) (1 mg спирамицинова основа е еквивалентен на 3200 международни единици (UI)).

2. Принцип

Пробата се извлича със смес на метанол/фосфат-бикарбонатен буфер при рН 8. Извлекът се декантира или центрофугира и разрежда. Неговата антибиотична активност се определя чрез измерване на дифузията на спирамицин в агар-агар среда, изкуствено заразена в Microccus luteus. Дифузията се показва чрез формиране на зони на инхибиране на микроорганизмите. Приема се, че диаметърът на тези зони е правопропорционален на логаритъма на антибиотичната концентрация в обхвата на използваните антибиотични концентрации.

3. Микроорганизъм: Microсоccus luteus АТСС 9341 (NCTC 834, NCIB 8553)

3.1. Поддържане на изходна култура

В тръби, съдържащи културална хранителна среда (4.1), се посява Microccus luteus и се слага в инкубатор за 24 часа при 30 °С. Културата се съхранява в хладилник при около 4 °С. Слага се отново в инкубатор на всеки 2 седмици.

3.2. Приготвяне на бактериалната суспензия(а)

Взема се продуктът на свежа хранителна среда агар-агар (3.1) с 2 до 3 ml разтвор на натриев хлорид (4.3). Тази суспензия се използва, за да се посее в 250 ml културална среда (4.1), съдържаща се в Roux колба и се поставя в инкубатор за 18 - 20 часа при 30 °С. Полученото се слага в 25 ml разтвор на натриев хлорид (4.3) и се разбърква. Суспензията се разрежда до 1/10 с разтвор на натриев хлорид (4.3). Прозрачността на суспензията трябва да бъде около 75 %, измерена при 650 nm в клетка 1 cm спрямо разтвор на натриев хлорид (4.3). Тази суспензия може да се съхранява една седмица при около 4 °С.

4. Културална среда и реактиви

4.1. Културална среда(б)

Месен пептон - 6,0 g

Триптон - 4,0 g

Екстракт от дрожди - 3,0 g

Месен екстракт - 1,5 g

Глюкоза - 1,0 g

Агар-агар - 10,0 до 20,0 g

Вода - 1000 ml

рН 6,5 до 6,6 (след стерилизация).

4.2. Културална среда за извършване на анализаб

Триптон - 5,0 g

Екстракт от дрожди - 4,0 g

Месен екстракт - 3,0 g

Агар-агар - 10,0 до 20,0 g

Вода - 1000 ml

рН 8,0 (след стерилизация).

4.3. Разтвор на натриев хлорид 0,8 % ( w/v).

Разтварят се 8 g натриев хлорид във вода и се разрежда до 1000 ml и се стерилизира.

4.4. Фосфатно-бикарбонатен буфер, рН 8,0

Двукалиев водороден фосфат К2НРO4 - 16,7 g

Калиев двуводороден фосфат КН2РO4 - 0,5 g

Натриев водороден карбонат NaHCO3 - 20,0 g

Вода до - 1000 ml.

4.5. Смес на метанолов фосфатно-бикарбонатен буфер (4.4) 50/50 (w/v).

4.6. Стандартна субстанция

Спирамицин с известна активност (в IU).

________________________

(*а) Могат да бъдат използвани други методи, в случай че се установи, че при тях се получават сходни бактериални суспензии.

(*б) Може да се използва културална среда от търговски характер със сходен състав, даваща същите резултати.

5. Стандартни разтвори

Разтваря се точно претеглено количество стандартна субстанция (4.6) в сместа (4.5) и се разтваря със същата смес, за да се получи изходен разтвор, съдържащ 1000 IU спирамицин на 1 ml. Съхраняван в запушена колба при 4 °С, този разтвор е стабилен до 5 дни.

От този изходен разтвор се приготвят чрез последователно разреждане със сместа (4.5) следните разтвори:

S8 - 1 - IU/ml

S4 - 0,5 - IU/ml

S2 - 0,25 - IU/ml

S1 - 0,125 - IU/ml.

6. Приготвяне на екстракта и разтворите за извършване на анализ

6.1. Извличане

Претегля се проба от 20 g при храни за животни и от 1 до 20 g при предварително приготвени смеси. Добавят се 100 ml от сместа (4.5) и се разтръсква в продължение на 30 min. Центрофугира се или се декантира и плаващият по повърхността слой се разрежда с разтвора (4.5), за да се получи очаквано съдържание на спирамицин от 1 IU/ml (= U8).

За очаквани нива на спирамицин, по-ниски от 2,5 mg/kg храна за животни, извличането се извършва, както следва: претеглят се 20 g проба; добавят се 100 ml от сместа (4.5) и се разтръсква в продължение на 30 min; центрофугира се в продължение на няколко min, вземат се 50 ml от плаващия на повърхността разтвор и се изпаряват до около 4 ml при намалено налягане в ротационен изпарител при температура, непревишаваща 40 °С. Остатъкът се разрежда със сместа (4.5), за да се получи очаквано съдържание на спирамицин от 1 IU/ml (= U8).

6.2. Разтвори за извършване на анализ

От разтвор U8 се приготвят разтвори U4 (очаквано съдържание 0,5 IU/ml), U2 (очаквано съдържание 0,25 IU/ml) и U1 (очаквано съдържание 0,125 IU/ml) чрез последователно разреждане (1+1) със сместа (4.5).

7. Процедура на извършване на анализа

7.1. Посяване на средата за изпитване

В средата за изпитване (4.2) се посява бактериалната суспензия (3.2) при около 50 °С. Чрез предварителни опити в петрита със среда за изпитване (4.2) се определя количеството на бактериалната суспензия, необходимо да се получат най-големите и най-ясни зони на инхибиране с различна концентрация на спирамицин.

7.2. Подготовка на петритата

Дифузията през агар-агар се извършва в петрита с четирите концентрации на стандартния разтвор (S8, S4, S2 и S1) и четирите концентрации на анализирания разтвор (U8, U4, U2 и U1). Тези четири концентрации на екстракта и стандарта трябва задължително да се поставят във всяко петри. В тази връзка се избират петрита, достатъчно големи, за да позволят в средата агар-агар да се направят поне 8 отвора с диаметър от 10 до 13 mm и не по-малко от 30 mm между центровете. Тестът трябва да се извърши в петрита, състоящи се от лист стъкло, покрит с алуминиев или пластмасов пръстен, поставен отгоре, с вътрешен диаметър 200 mm и височина 20 mm.

В петритата се излива част от средата (4.2), посята както в 7.1, за да се получи слой, дебел около 2 mm (60 ml за петри с диаметър 200 mm). Оставя се да се изравни, пробиват се дупките и в тях се обозначават точно премерени обеми от разтворите за анализиране и стандартните разтвори (между 0,10 и 0,15 ml на дупка в зависимост от диаметъра). Всяка концентрация се полага поне 4 пъти, така че на всяко определяне да подлежат на оценка 32 зони на инхибиране.

7.3. Поставяне в инкубатор

Петритата се поставят в инкубатор за 16 - 18 часа при температура 30 ± 2 °С.

8. Оценяване

Измерва се диаметърът на зоните на инхибиране с точност 0,1 mm. Отбелязват се средноаритметичните стойности на измерванията за всяка концентрация върху милиметрова хартия, показваща логаритъма на концентрациите във връзка с диаметрите на зоните на инхибиране. Начертават се линиите на най-добро съответствие на стандартния разтвор и екстракта.

Определя се "най-точно съответстващата" точка за стандартното най-ниско ниво (SL), като се използва формулата:

SL = (7S1 + 4S2 + S4 - S8) / 10 .

Определя се "най-точно съответстващата" точка за стандартното най-високо ниво (SH), като се използва формулата:

SH = (7S8 + 4S4 + S2 - S1) / 10 .

По подобен начин се изчисляват и "най-точно съответстващите" точки за най-ниските нива на екстракта (UL) и най-високите нива на екстракта (UH), като във формулите се заменят S1, S2, S4 и S8 с U1, U2, U4 и U8 (Малките букви "s" и "u" се отнасят за диаметрите на зоните на инхибиране.).

Изчислените стойности на SL и SH се нанасят на същата милиметрова хартия и се свързват, за да се получи линията на "най-точно съответствие" за стандартния разтвор. По подобен начин се нанасят UL и UH и се свързват, за да се получи линията на "най-точно съответствие" за екстракта.

При отсъствие на интерференции линиите трябва да са паралелни. За практически цели линиите могат да се считат паралелни, ако стойностите (SH - SL) и (UH - UL) не се различават с повече от 10% от тяхната средна аритметична стойност.

Ако се окаже, че линиите не са паралелни, u1 и s1 или u8 и s8 могат да се изключат и SL, SH, UL и UH да се изчислят, като се използват алтернативните формули, за да се получат линиите на "най-точно съответствие":

и по-подобен начин за UL и UH. Трябва да бъде удовлетворен същият критерий за успоредност. Фактът, че резултатът е изчислен от три нива, трябва да бъде отбелязан в крайния отчет.

Когато линиите се считат за успоредни, се изчислява логаритъмът на относителна активност (log A) посредством една от следните формули в зависимост от това, дали са използвани три или четири нива за оценка на успоредността.

За четири нива -

Активността на пробвания екстракт е равна на активността на релевантния стандарт, умножена по А:

(U8 = S8 x A).

Ако относителната активност се окаже извън обхвата от 0,5 до 2, анализът се повтаря, като се правят подходящи корекции на концентрациите на екстракта или ако това не е възможно - на стандартните разтвори. Когато относителната активност не може да се доведе в изисквания обхват, всеки получен резултат се счита за приблизителен и това се отбелязва в крайния отчет.

Когато линиите не могат да се считат за успоредни, определянето се повтaря. Ако пак не може да се получи успоредност, определянето се счита за незадоволително.

Резултатите се изразяват в mg спирамицинова база на kg храна за животни.

9. Повторяемост

Разликата между резултатите на две успоредни определяния, направени на същата проба от същия лаборант, не трябва да превишава:

- 2 mg/kg в абсолютна стойност - за съдържание на спирамицинова база до 10 g/kg;

- 20% от най-високата стойност - за съдържания от 10 до 25 mg/kg;

- 5 mg/kg в абсолютна стойност - за съдържание от 25 до 50 mg/kg;

- 10% от най-високата стойност - за съдържания над 50 mg/kg.

LII. Определяне на количеството влакнеста маса

1. Цел и обхват

Този метод позволява определянето на органични субстанции без мазнини в храни, които са неразтворими в киселини и основи и са наричани конвенционално влакнеста маса.

2. Принцип

Образецът, обезмаслен, когато е необходимо, се третира последователно с кипящи разтвори на сярна киселина и калиев хидроокис с определени концентрации. Утайката се отделя чрез филтриране с помощта на филтър от синтеровано стъкло, след което се изпира, изсушава, претегля и изгаря до пепел при температури в диапазона от 475 до 500 °С. Намалението в теглото, получено в резултат на изгарянето до пепел, съответства на влакнестата маса, налична в изпитвания образец.

3. Реагенти

3.1. Сярна киселина, с = 0,13 mol/l.

3.2. Агент срещу образуване на пяна (например n-октанол).

3.3. Филтрираща маса (Селит 545 или еквивалент), загрята на температура 500 °С в продължение на четири часа (8.6).

3.4. Ацетон

3.5. Петролен етер с диапазон на кипене от 40 до 60 °С.

3.6. Солна киселина, с = 0,5 mol/l.

3.7. Разтвор на калиев хидроокис,

с = 0,23 mol/l.

4. Уреди

4.1. Загряващо устройство за обработка със сярна киселина или с разтвор на калиев хидроокис, оборудвано с поставка за филтърния тигел (4.2) и снабдено с извеждаща тръба с кран към резервоар за течности и към вакуум. Възможно е да се използва сгъстен въздух. Преди използване всеки ден устройството се затопля с кипяща вода в продължение на пет минути.

4.2. Стъклен филтърен тигел с филтърна плоскост от синтеровано стъкло с филтърни пори с размер 40 - 90 µm. Преди първа употреба се загрява до 500 °С за няколко минути и се изстудява (8.6).

4.3. Цилиндър с обем най-малко 270 ml, снабден с обратен втечнител, подходящ за кипене.

4.4. Пещ за сушене с термостат.

4.5. Пещ за изпичане на порцелан с термостат.

4.6. Устройство за извличане, състоящо се от поддържаща плоскост за филтърния тигел (4.2), и с тръба за оттичане с кран към вакуум и към резервоар за течности.

4.7. Свързващи обръчи за монтаж на загряващото устройство (4.1), филтърния тигел (4.2) и цилиндъра (4.3) и за свързване на устройството за студено извличане (4.6) и тигела.

5. Процедура

1 g от подготвения образец се претегля с точност до най-близките 0,001 g и се поставя в тигела (4.2) (виж наблюдения 8.1, 8.2 и 8.3) и се добавя 1 g от филтриращата маса (3.3).

Сглобяват се загряващото устройство (4.1) и филтърният тигел (4.2), след което към тигела се добавя цилиндърът. 150 ml от кипящата сярна киселина (3.1) се наливат в сглобените цилиндър и тигел и ако е необходимо, се добавят няколко капки от агента срещу образуване на пяна (3.2).

Течността се довежда до точката на кипене в рамките на 5 ± 2 минути и се оставя силно да кипи точно 30 минути.

Отваря се кранът към резервоара за течности (4.1) и при условия на вакуум сярната киселина се филтрира през филтърния тигел. Утайката се изпира с три последователни порции от по 30 ml кипяща вода, като при това утайката се изсушава след всяко изпиране.

Кранът към резервоара за течности се затваря и в сглобените цилиндър и тигел се наливат 150 ml кипящ калиев хидроокис (3.7) и се добавят няколко капки от агента срещу образуване на пяна (3.2). Течността се довежда до точката на кипене в рамките на 5 ± 2 минути и се оставя силно да кипи точно 30 минути. Филтрира се и се повтаря процедурата по изпиране, използвана на етапа с използване на сярна киселина.

След финалното изпиране и изсушаване тигелът и неговото съдържимо се отделят и се свързват отново към устройството за студено извличане (4.6). Прилага се вакуум и утайката се изпира в тигела с три последователни порции от по 25 ml ацетон (3.4), като при това тя се изсушава след всяко изпиране.

Тигелът се изсушава до постоянно тегло в пещ при температура 130 °С. След всяко изсушаване съдържимото на тигела се изстудява в сушилня и бързо се претегля. Тигелът се поставя в пещ за изпичане на порцелан и неговото съдържимо се изгаря до пепел с постоянно тегло при температури в диапазона от 475 до 500 °С за най-малко 30 минути.

След всяко загряване се изстудява първо пещта и след това сушилнята преди претегляне.

Провежда се контролно изпитване без образеца. Загубата на тегло в резултат на изгарянето до пепел не трябва да превишава 4 mg.

6. Изчисляване на резултатите

Съдържанието на влакнеста маса е процент от образеца, получен по формулата:

където

a = масата на образеца в g;

b = загубата на маса след изгаряне до пепел по време на изпитването за определяне на количеството влакнеста маса, в g;

c = загубата на маса след изгаряне до пепел след контролното изпитване, в g;

7. Повторимост

Разликата между две паралелни определяния на количеството влакнеста маса, проведени върху един и същ образец, не трябва да надхвърля:

- 0,3 по абсолютна стойност за съдържание на влакнеста маса под 10 %;

- 3 % по отношение на най-високия резултат за съдържание на влакнеста маса, равно или по-голямо от 10 %.

8. Наблюдения

8.1. Храни, съдържащи повече от 10 % влакнеста маса, трябва да бъдат обезмаслени преди анализа с петролен етер (3.5). Филтърният тигел (4.2) и неговото съдържимо се свързват с устройството за студено извличане (4.6), прилага се вакуум и утайката се изпира с три последователни порции от по 30 ml петролен етер, като при това се осигурява утайката да е суха. Тигелът и неговото съдържимо се свързват към устройството за загряване (4.1) и се продължава, както е описано в т. 5.

8.2. Храни, съдържащи мазнини, които не могат да бъдат извлечени директно с петролен етер (3.5), трябва да бъдат обезмаслени, както е показано в т. 8.1, и още веднъж обезмаслени след кипене с киселина.

След кипене с киселина и последващото изсушаване тигелът и неговото съдържимо се свързват към устройството за студено извличане (4.6) и се изпират три пъти с по 30 ml ацетон, последвани от три следващи изпирания с порции от по 30 ml петролен етер. Извършва се филтриране във вакуум до изсушаване и анализът се продължава, както е описано в т. 5, като се започва с обработка с калиев хидроокис.

8.3. Ако храните съдържат повече от 5 % карбонати, изразени в калциев карбонат, тигелът (4.2) с претегления образец се свързват към устройството за загряване (4.1). Образецът се изпира три пъти с по 30 ml солна киселина (3.6). След всяко добавяне образецът се оставя за около една минута преди филтриране. Изпира се веднъж с 30 ml вода и след това се продължава както е описано в т. 5.

8.4. Ако се използва уред във формата на стенд (няколко тигела, прикрепени към едно и също загряващо устройство), то две индивидуални определяния на един и същи образец за анализ не могат да бъдат направени в една и съща серия.

8.5. Ако след кипене е трудно да се филтрират киселини и основи, използва се сгъстен въздух през тръбата за оттичане на загряващото устройство и след това филтрирането продължава.

8.6. Температурата на изгарянето до пепел не трябва да бъде по-висока от 500 °С, за да се удължи животът на стъклените филтърни тигели. Трябва да се внимава да не се предизвика температурен шок по време на циклите на загряване и изстудяване.

LIII. Насоки за оценка на някои продукти, използвани при храненето на животните

Общи аспекти

Настоящите насоки представляват наръчник, предназначен за изготвянето на документация за продуктите, изброени в точки 1.1 и 1.2 от Приложението към Директива 82/471/ЕИО, получени от култивиране на микроорганизми и за които има вероятност да бъдат допуснати като нов източник на протеини при храненето на животните. Чрез тази документация следва да се направи оценка на въпросните продукти въз основа на настоящото състояние на познанията и следва да гарантират тяхното съответствие с фундаменталните принципи, определени с цел допускане на тяхната употреба, които са предмет на член 6, параграф 2 от гореупоменатата директива.

Могат да бъдат поискани всички изследвания, очертани в този документ, и при необходимост да се поиска допълнителна информация. Като общо правило трябва да се осигури цялата информация, необходима за установяване идентичността на микроорганизма и състава на културната среда, както и производствения процес, характеристиката, представянето, условията на употреба, методите за определяне и хранителните свойства на продукта. Същото важи за информацията, необходима за оценяване на допустимото ниво на продукта посредством целевите видове и рисковете за човека и за околната среда, които пряко или непряко произтичат от използването на продукта. Токсикологичните изследвания, необходими за тази цел, зависят от естеството на продукта, съответните животински видове и метаболизма на продукта в лабораторните животни.

Документацията, която следва да се предостави, трябва да включва подробни доклади, представени в съответния ред и с номерирането, предложени тези насоки и придружена от резюме. Липсата на което и да е от предложените изследвания трябва да бъде аргументирана. Прилагат се публикациите, цитирани като препратки.

Наблюдения

Терминът "продукт", така както се използва в настоящите насоки, се отнася за който и да е съдържащ протеини продукт - в състоянието, в което той ще се представя като храна за животни или като компонент от храна за животни.

При всяка промяна в производствения процес или в условията за употреба на продукта ще се изисква уведомяване и при необходимост допълнителна документация за нова оценка.

Представяне на изследванията

I. Микроорганизъм, културна среда и производствен процес, характеристики на продукта, представяне и условия на употреба, методи на определяне

II. Изследвания за хранителните свойства на продукта

III. Изследвания за биологичните последици от употребата на продукта при храненето на животните

IV. Други подходящи изследвания

Раздел І

Микроорганизъм, хранителна среда и производствен процес, характеристики на продукта, представяне и условия на употреба, методи на определяне

1. Микроорганизъм

1.1. Класификация, произход, морфология, биологични свойства, генетични манипулации.

1.2. Безвредност, възможно оцеляване извън ферментора и последици за околната среда.

1.3. Устойчивост и чистота на култивираните щамове, методи, използвани за проверка на тези критерии.

2. Културна среда и производствен процес

2.1. Състав на субстрата, добавени субстанции и т. н.

2.2. Процеси на производство, изсушаване и очистване. Процес на умъртвяване на микроорганизмите. Методи, използвани за проверка константността на състава на култивирания продукт и откриване на всякакви химически, физически и биологични замърсители по време на производството.

2.3. Технически процеси на подготовка за употреба.

3. Характеристики на продукта

3.1. Физически и физико-химични свойства: макро- и микроморфология, размер на частиците, плътност, специфично тегло, хигроскопичност, разтворимост, електростатични свойства и т.н.

3.2. Химически състав и характеристики

3.2.1. Съдържание на влага, груб протеин, груби масти, груба целулоза, груба пепел, въглехидрати, граници за вариране на тези съдържания.

3.2.2. Съдържание на общия амоняк, амин, нитрат и нитритен нитроген, нуклеинови киселини, протеин, количествен и качествен състав на общите и на свободните аминокиселини и на пириновите и пиримидиновите бази.

3.2.3. Количествен и качествен състав на общите липиди: мастни киселини, несапунообразуваща материя, разтворими в липиди пигменти, фосфолипиди.

3.2.4. Състав на въглехидратната фракция.

3.2.5. Количествен и качествен състав на неорганичните компоненти.

3.2.6. Количествен и качествен състав на витамините.

3.2.7. Количествен и качествен състав на другите съставки: добавки, остатъци от субстрата и разтворителите, други потенциално вредни остатъци от метаболизма на субстрата, на културната среда, на производствения процес.

3.3. Микробиологично замърсяване на продукта.

3.4. Поведение и стабилност на продукта - като такъв и когато е смесен с храни в текуща употреба, по време на съхранението му.

4. Представяне и условия на употреба

4.1. Предложени имена за търговия на продукта.

4.2. Предложени формули за търговия на продукта.

4.3. Планирана употреба на продукта при храненето на животните. Планирани концентрации в пълноценни фуражи и в планираните количества за дневните дажби за съответните животински видове.

5. Методи на определяне

Количествени и качествени методи за определяне на продукта в комплектни и в допълващи храни.

NB Описанието на тези методи се придружава от информация относно специфичност, чувствителност, граници на откриване, граници на грешка, възможни намеси от страна на други субстанции. Трябва да има представени мостри от продукта в неговите различни предложени представяния.

Раздел ІІ

Изследвания за хранителните свойства на продукта

1. Оценка на протеиновата стойност

1.1. Химични, биохимични и микробиологични изследвания.

1.2. Изследвания върху лабораторни животни, сравнени с оглед протеините.

2. Изследвания върху целеви видове

За всеки целеви вид трябва да се направят следните изследвания в сравнение с контролната група, която получава, при същите условия на хранителен баланс, диета в текуща употреба, съдържаща еквивалентни количества от протеинов азот, за преживни животни с общ азот.

2.1. Протеин и стойност на енергийната добавка на продукта в дажбите съгласно предложените условия на употреба при различните физиологични стадии (например в периода на растеж, бременност, люпене).

2.2. Влиянието на продукта при предложените условия на употреба върху степента на растеж, степен на усвояване на храната, заболеваемост, смъртност.

2.3. Оптимални хранителни нива на включване на продукта в дажбите.

2.4. Ефектът на продукта при предложените условия на употреба върху технологичните, органолептичните или другите качества на ядливите продукти с животински произход.

3. Експериментални условия в изследванията върху целевите видове

Да се направи подробно описание на проведените тестове, като се уточнят следните данни:

3.1. Вид, подвид, възраст и пол на животните, процедура за идентификация.

3.2. Брой на тестовете и контролните групи, брой на животните във всяка от групите (броят трябва да е достатъчно голям за статистически анализ с използване на подходящи статистически параметри).

3.3. Нива на включване на продукта, количествен и качествен състав на дажбата и нейния анализ.

3.4. Местоположение на всеки експеримент, физиологично състояние и условия за здравето на животните, условия за отглеждане (последните трябва да отразяват тези условия, които се използват на практика в Общността).

3.5. Точна продължителност на тестването и дата на проведения анализ.

Раздел ІІІ

Изследвания за биологичните последици от употребата на продукта при храненето на животните

Изследванията, очертани в този раздел, са предназначени да позволят оценка на безопасността при употребата на продукта в целевите видове и рисковете за човека и за околната среда, които биха могли да се получат пряко или косвено от тази употреба. Токсикологичните изследвания, необходими за тази цел, ще зависят от естеството на продукта, от съответния животински вид и метаболизма на продукта в лабораторните животни.

1. Изследвания върху целеви видове

За всеки целеви вид следва да се направят следните изследвания в сравнение с контролната група, която получава, при същите условия на хранителен баланс, диета в текуща употреба, съдържаща еквивалентни количества от протеинов азот, за преживни животни с общ азот.

1.1. Максимални степени на включване на продукта в дневната дажба, без при това да се създава неблагоприятен ефект.

1.2. Възможният ефект от продукта върху плодородието и възпроизводството по целесъобразност.

1.3. Ефектите от консумацията на продукта при предложените условия на употреба на микроорганизмите във флората на хранопровода и върху колонизацията на патогенни микроорганизми в хранопровода.

1.4. Проучване при предложените условия на употреба на възможните остатъци от продукта (субстрат, културна среда, разтворители, замърсители) в ядливите продукти от животински произход.

1.5. Проучване при предложените условия на употреба на възможните остатъци от продукта (субстрат, културна среда, разтворители, замърсители) в екскрементите.

2. Изследвания върху лабораторни животни

2.1. Метаболизъм

Съдбата на продукта в животното: усвояване, натрупване, биологично превръщане, елиминиране.

2.2. Мутагенност

Проучване на потенциалната мутагенност поради замърсители (по-специално микотоксини и бактерии) или остатъци от продукта (субстрат, културна среда, разтворители), включително в тестовете със скрининг ин витро, като се използват системи за активиране на метаболизма.

2.3. Токсикологични изследвания

Долупосочените изследвания трябва да се направят в сравнение с контролни групи, получавайки - при същите условия на хранителен баланс, диета в текуща употреба, съдържаща еквивалентни количества протеинов азот. Трябва да се изследват токсичните ефекти, така че да се осветли тяхната причина и механизмите и да се гарантира, че те не се получават в резултат на хранителния дисбаланс или от свръхдоза на продукта в диетата.

2.3.1. Субхронична токсичност (поне 90 дни)

Най-общо тези изследвания трябва да се проведат върху два животински вида, като единият от тях е гризач. Продуктът трябва да се администрира в дневната дажба в поне две нива на включване. Тези нива трябва да бъдат избрани по такъв начин, че да се определи, ако е възможно, нивото на липса на ефект и ниво, което да показва известен неблагоприятен ефект. Групите животни трябва да включват адекватен брой субекти от всеки пол. При опита винаги трябва да се включва една контролна група.

Всички релевантни биологични данни трябва да бъдат записвани на подходящи интервали от време, особено данните за степента на растеж, консумацията на храна, хематологията, анализът на урината, биохимичните параметри, смъртността, теглото на органите, общата патология и хистопатология на основните органи и тъкани. Резултатите трябва да се представят в детайли и доколкото това е възможно, да включват и статистическа оценка.

2.3.2. Хронична токсичност

Най-общо изследванията за хронична токсичност трябва да се проведат върху два животински вида, като единият от тях е гризач. Продуктът трябва да се администрира в дневната дажба в поне две нива на включване. Експериментите трябва да продължат поне две години при плъхове или 80 седмици при мишки. Групите животни трябва да включват адекватен брой субекти от всеки пол. При опита винаги трябва да се включва една контролна група.

За предпочитане е биологичните изследвания, посочени в точка 2.3.1, да се проведат върху малка сателитна група от животни (една група, разделена от и зависима от основната група) на подходящи интервали от време през време на целия експеримент и върху преживелите животни в края на експеримента.

2.3.3. Канцерогенност

За оценката на канцерогенност трябва да се обърне особено внимание на времето на появата, хистологичните типове на всякакви наблюдавани тумори и тяхната повторяемост. Всеки ефект върху повторяемостта на туморите и/или повторяемостта или напредъка на заболяванията трябва да се оценяват с препратка към контролните групи, така както е посочено в параграф 2.3. Резултатите трябва да се представят в детайли и доколкото това е възможно, да включват и статистическа оценка.

2.4. Други изследвания

Изследванията за възпроизводство трябва да обхващат поне две дъщерни поколения и могат да бъдат комбинирани с изследвания за ембриотоксичност, включително и тератогеничност. Специално внимание трябва да се обърне на плодовитостта, продуктивността и на наблюденията върху следродовото развитие на поколенията. Може да се предвиди и всякакъв друг метод, който е научно аргументиран и за който е вероятно да доведе до измерими резултати (например "relay toxicity").

2.5. Експериментални условия в изследванията върху лабораторните животни

Да се направи подробно описание на проведените тестове, като се уточнят следните данни:

2.5.1. Вид, подвид, щам и пол на животните, процедура на идентификация.

2.5.2. Брой на тестовете и контролните групи, брой на животните във всяка от групите (броят трябва да е достатъчно голям за статистически анализ, като се използват подходящи статистически параметри).

2.5.3. Нива на включване на продукта, количествен и качествен състав на дажбата и нейния анализ.

2.5.4. Общи условия за научна подкрепа през време на целия период на тестване.

2.5.5. Точна продължителност на тестването и дата на проведеното изследване.

2.5.6. Процент и разпределение на смъртността във всяка партида.

2.5.7. Клинични симптоми и патологични изменения, възникнали по време на експеримента и момента на появата им.

3. Изследвания, свързани с околната среда

Според естеството на възможните остатъци (субстрат, културна среда, разтворители, замърсители) в изпражненията на целевите видове могат да бъдат изискани данни за промяната на тези остатъци в торовете, почвите, водите, както и за ефекта им върху биологичния състав на почвата, растителността и водните организми.

Раздел ІV

Други подходящи изследвания

Според естеството и условията на употреба на продукта могат да бъдат изискани данни, свързани с алергията, раздразнението на кожата, очните, дихателните или хранителните лигавици, за да се направи оценка на потенциалните рискове по време на обработката на продукта и те да бъдат предотвратени.

LIV. Метод за изчисление на енергийната стойност на храните за домашни птици

1. Метод за изчисление и формула на енергийната стойност

Енергийната стойност на комбинираните храни за домашни птици трябва да бъде изчислявана в съответствие с посочената по-долу формула въз основа на процентното съдържание на определените за анализ хранителни компоненти. Тази стойност трябва да бъде изразена в мегаджаули (MJ) обменна енергия (ОЕ), отделен азот на килограм от хранителната смес:

MJ/kg ОЕ = 0,1551 Ч % суров протеин + 0,3431 Ч % сурови мазнини + 0,1669 Ч % скорбяла + 0,1301 Ч % общо захари (изразени като захароза).

2. Допустими отклонения от декларираните стойности

Ако официалната проверка, предвидена в член 12, установи несъответствие (повишена или занижена енергийна стойност на храната за животни) между резултата от проверката и декларираната енергийна стойност, се допуска минимално отклонение от 0,4 MJ/kg ОЕ.

3. Израз на резултата

След прилагането на гореизложената формула полученият резултат трябва да бъде отчетен до първия знак след десетичната запетая.

4. Методи за вземане на проби и анализ

Вземането на проби от комбинираната храна и определянето на съдържанието на компонентите за анализ, посочени в метода за изчисление, трябва да бъде извършено в съответствие с общностните методи за вземане на проби или в съответствие с методите за анализ, използвани при официалния контрол на храните за животни."