НАРЕДБА № 43 ОТ 4 ОКТОМВРИ 2002 Г. ЗА ПРОФИЛАКТИКА И БОРБА С БОЛЕСТТА АФРИКАНСКА ЧУМА ПО КОНЕТЕ
НАРЕДБА № 43 ОТ 4 ОКТОМВРИ 2002 Г. ЗА ПРОФИЛАКТИКА И БОРБА С БОЛЕСТТА АФРИКАНСКА ЧУМА ПО КОНЕТЕ
Обн. ДВ. бр.98 от 18 Октомври 2002г., отм. ДВ. бр.6 от 20 Януари 2006г.
Отменена с § 2 от заключителните разпоредби на Наредба № 24 от 14 декември 2005 г. за мерките за профилактика, ограничаване и ликвидиране на африканската чума по конете и за условията и реда за прилагането им - ДВ, бр. 6 от 20 януари 2006 г., в сила от 1 май 2006 г.
Раздел I.
Общи положения
Чл. 1. С тази наредба се определят:
1. мерките за предпазване от проникване и разпространение, ограничаване и ликвидиране на болестта африканска чума по конете (АЧК);
2. методите за диагностика на болестта АЧК;
3. задълженията на държавните органи, на физическите и юридическите лица при прилагането на мерките и методите по т. 1 и 2.
Чл. 2. Болестта африканска чума по конете подлежи на регистриране и обявяване по реда на Наредба № 21 от 2002 г. за обявяване и регистриране на заразните и паразитните болести по животните (ДВ, бр. 55 от 2002 г.).
Чл. 3. (1) Националната ветеринарномедицинска служба (НВМС) изготвя оперативен план за прилагане на мерките и методите по чл. 1, т. 1 и 2, който се утвърждава от генералния директор на НВМС.
(2) Съдържанието на оперативния план по ал. 1 е посочено в приложение № 1.
Раздел II.
Мерки за предпазване от проникване и разпространение на болестта африканска чума по конете
Чл. 4. Органите на НВМС:
1. регистрират животновъдните обекти и идентифицират еднокопитните животни в тях по реда на чл. 32 от Закона за ветеринарномедицинската дейност (ЗВД), като отбелязват техния вид, порода и брой;
2. контролират придвижването, пазарите, изложбите и спортните състезания с еднокопитни животни;
3. извършват наблюдение и проучване на видовия състав на мокреците от рода "Куликоиде" и други преносители на вируса на АЧК и вирусологично изследване на проби от тях;
4. извършват дезинфекция и дезинсекция на влизащите в страната транспортни средства, които превозват еднокопитни животни.
Чл. 5. (1) При установяване на болестта АЧК в съседни страни в пограничните райони освен мерките по чл. 4 НВМС провежда и:
1. ежеседмични клинични прегледи на еднокопитните животни;
2. сондажни серологични изследвания.
(2) Когато местонахождението на констатираното огнище на болестта АЧК е на по-малко от 150 км от границата с Република България, НВМС предприема мерките по раздел V след съгласуване с държавната ветеринарна служба на засегнатата страна.
Чл. 6. Кметовете на общини:
1. водят регистър на собствениците и броя на притежаваните от тях еднокопитни животни;
2. определят със заповед състава на местната епизоотична комисия и организират нейната работа;
3. организират изпълнението на мерките за предпазване, ограничаване и ликвидиране на АЧК в съответния регион.
Чл. 7. Собствениците на еднокопитни животни:
1. изграждат животновъдните обекти за отглеждане на еднокопитни животни при условията и по реда на чл. 50 от Правилника за прилагане на Закона за ветеринарномедицинската дейност (ДВ, бр. 55 от 2000 г.);
2. декларират броя и вида на притежаваните от тях еднокопитни животни в съответната община или кметство при условията на чл. 34, т. 1 ЗВД;
3. предоставят еднокопитните животни за клинични прегледи и лабораторно-диагностични изследвания на ветеринарномедицинските органи;
4. предават на екарисаж или обезвреждат труповете на еднокопитните животни по указание на ветеринарен лекар.
Раздел III.
Мерки при съмнение за възникване на болестта африканска чума по конете
Чл. 8. (1) При съмнение за АЧК ветеринарният специалист, който обслужва животновъдния обект, незабавно уведомява регионалната ветеринарномедицинска служба (РВМС), която изпраща на място държавен ветеринарен лекар.
(2) До идването на държавен ветеринарен лекар от РВМС ветеринарният специалист, който обслужва животновъдния обект:
1. изолира съмнително болните за АЧК еднокопитни животни в затворено помещение;
2. забранява придвижването, разместването и прегрупирането на всички еднокопитни животни в обекта, в който се отглеждат;
3. забранява на лицата, работещи в обекта, да посещават други животновъдни обекти, в които се отглеждат еднокопитни животни.
Чл. 9. При установяване на клинични признаци у еднокопитните животни, които потвърждават съмнението за заболяване от АЧК, освен мерките по чл. 8, ал. 2 държавният ветеринарен лекар:
1. забранява влизането на външни лица в обекта;
2. забранява вкарване, изкарване и преместване на еднокопитни животни, постеля, фураж, тор, инвентар, транспортни средства и други предмети, които могат да бъдат преносители на вируса на АЧК;
3. дава указание за обезвреждане на труповете, ако има такива, при условията и по реда на чл. 2, ал. 2 и чл. 16, ал. 2 от Наредба № 29 от 2002 г. за ветеринарно-санитарните изисквания при събирането и обезвреждането на отпадъци от животински произход (ДВ, бр. 75 от 2002 г.);
4. забранява осеменяването, кръвните и други профилактични манипулации на еднокопитните животни;
5. разпорежда прибирането на еднокопитните животни в затворено помещение или на място, където животните могат да бъдат предпазени от мокреците;
6. съставя, съхранява и актуализира при всяко посещение в животновъдния обект списък, който съдържа броя на заболелите, умрелите и застрашените от заразяване еднокопитни животни;
7. извършва епизоотологично проучване за изясняване:
а) произхода на инфекцията;
б) предполагаемата дата на възникване на болестта АЧК и начина на проникване на инфекцията в засегнатия обект;
в) наличието на други обекти, където се отглеждат еднокопитни животни, които биха могли да бъдат заразени с вируса на АЧК от същия източник;
г) броя и вида на еднокопитните животни, напуснали засегнатия обект, и мястото на пребиваването им до 28 дни преди предполагаемото проникване на вируса;
д) наличието и разпространението на преносителите на болестта;
8. извършва клиничен преглед на всички еднокопитни животни в засегнатия обект;
9. извършва аутопсия на умрелите еднокопитни животни и взема материал за лабораторно изследване по указания, дадени от Главно управление (ГУ) на НВМС;
10. проучва наличието на мокреци и предприема подходяща дезинсекция с цел тяхното унищожаване;
11. уведомява кмета и собствениците на еднокопитни животни в населеното място за опасността от възникване на болестта АЧК и предприетите мерки.
Чл. 10. Ако при проучването по чл. 9, т. 7 възникне съмнение за заразяване с АЧК на еднокопитни животни в други животновъдни обекти, в тях се предприемат мерките по чл. 9.
Чл. 11. Националната ветеринарномедицинска служба отменя мерките по чл. 9, когато въз основа на епизоотологичните, клиничните и патологоанатомичните данни, както и резултатите от лабораторните изследвания по чл. 14, ал. 1, се докаже, че отпада съмнението за болестта АЧК.
Раздел IV.
Диагностика на болестта африканска чума по конете
Чл. 12. (1) При съмнение за АЧК ГУ на НВМС изпраща специализиран диагностичен екип на място.
(2) Екипът по ал. 1 извършва епизоотологично проучване, клиничен преглед, аутопсия на умрелите животни и взема материали за лабораторно изследване за изолиране на вируса, както следва:
1. кръвни проби, взети по време на температурния стадий на болестта и консервирани в разтвор, съдържащ 50 % глицерин, 0,5 % калиев оксалат и 0,5 % фенол или хепарин 10 UI/мл;
2. парченца от далак, бял дроб, лимфни възли с тегло от 2 до 4 г, в 10 % буфериран глицерин;
3. куликоиди - 10 сборни проби с най-малко 300 насекоми във всяка една от тях;
4. кръвни серуми от болни и съмнително болни животни.
(3) Материалите за лабораторно изследване се транспортират в хладилна чанта при температура 4градуса С.
Чл. 13. (1) Лабораторното изследване за поставяне на диагнозата се извършва в специализирана лаборатория за АЧК, определена по реда на чл. 14, ал. 3 ЗВД.
(2) Националната ветеринарномедицинска служба осъществява постоянен контрол за спазване на изискванията за безопасност при работа с вируса на АЧК в лабораторията по ал. 1.
Чл. 14. (1) Лабораторните изследвания се извършват чрез:
1. изолиране на вируса:
а) върху чувствителни клетъчни култури;
б) чрез интравенозна инокулация на 10 - 11- дневни кокоши ембриони;
в) чрез интрацеребрална инокулация на новородени бозаещи мишлета;
2. идентификация на вируса чрез:
а) реакция ЕЛАЙЗА (ензим свързан имуносорбентен метод) - с хомогенати от миши мозък, органи и клетъчно културална течност;
б) реакция вируснеутрализация за определяне на серотипа на вируса;
в) полимеразно верижна реакция;
3. извършване на серологична диагноза с помощта на:
а) реакция сравнителна ЕЛАЙЗА за доказване на антитела срещу вируса на АЧК;
б) реакция индиректна ЕЛАЙЗА за доказване на антитела срещу вируса на АЧК;
в) реакция блокираща ЕЛАЙЗА за доказване на антитела срещу вируса на АЧК;
г) реакция за свързване на комплемента;
д) реакция имуноблотинг.
(2) Лабораторните изследвания по ал. 1 се извършват съгласно приложение № 2.
Чл. 15. Ръководителят на лабораторията по чл. 13, ал. 1:
1. поддържа постоянна диагностична готовност;
2. незабавно изследва получените проби;
3. уведомява за резултата ГУ на НВМС, съответната РВМС и ветеринарния лекар, обслужващ съответния участък, за резултатите от изследванията по т. 2;
4. използва утвърдените от Международното бюро по епизоотии методи за диагностика;
5. в случай на нужда снабдява с реактиви регионални лаборатории по тяхна молба;
6. извършва контрол върху качеството на всички реактиви, използвани при извършване на отделните изследвания;
7. периодично организира провеждането на сравнителни тестове;
8. съхранява изолатите на вируса на АЧК от потвърдени случаи в страната;
9. изпраща проби за потвърждаване на диагнозата АЧК в Референтната лаборатория на Европейския съюз.
Чл. 16. Диагноза АЧК се поставя въз основа на епизоотологичните, клиничните и патологоанатомичните данни, както и от резултатите от лабораторните изследвания по чл. 14, ал. 1.
Раздел V.
Мерки за ограничаване и ликвидиране на болестта африканска чума по конете
Чл. 17. (1) При лабораторно потвърждаване на болестта АЧК НВМС:
1. обявява болестта АЧК по реда на чл. 2;
2. определя границите на заразена зона "А", предпазна зона "Б" и наблюдавана зона "В" в зависимост от географските, административните, метеорологичните и екологичните особености, свързани с болестта АЧК.
(2) Националната ветеринарномедицинска служба може да разшири границите на зони "А", "Б" или "В" в зависимост от особеностите по ал. 1, т. 2.
(3) Когато територията на някоя от зоните включва територия на съседна страна, НВМС си сътрудничи с държавните ветеринарни служби на тази страна при определяне границите на зоните и мерките, които се предприемат в тях.
Чл. 18. (1) Зона "А" обхваща:
1. епизоотичните огнища със засегнатите от болестта АЧК обекти;
2. територията на цялото населено място, в което е регистрирано епизоотичното огнище;
3. територията в радиус 20 км от епизоотичното огнище;
4. животновъдните обекти с еднокопитни животни извън 20-километровата зона, имали връзка с епизоотичното огнище 28 дни преди появата на първите клинични признаци на болестта АЧК.
(2) В зона "А" държавният ветеринарен лекар предприема мерките по чл. 9, както и:
1. забранява придвижването, пазарите, изложбите и спортните състезания с еднокопитни животни;
2. разпорежда:
а) умъртвяване по безкръвен начин на всички еднокопитни животни, показващи клинични признаци за болестта АЧК, и тези, показали положителен резултат при лабораторното изследване за АЧК;
б) обезвреждане на труповете на животните по реда на чл. 9, т. 3;
в) извършване на дезинсекция в обектите, в които се отглеждат еднокопитни животни, и около тях и в биотопите с преносителите на болестта АЧК съгласно приложение № 3;
г) основно механично почистване, извършване на дезинфекция и дератизация в обектите с еднокопитни животни, транспортни средства, пътища, околен терен;
д) поставяне на предупредителни надписи за АЧК пред засегнатите населени места и обекти;
е) извършване на ежедневни клинични прегледи (с измерване на температурата) на еднокопитните животни в населеното място, в което се намира епизоотичното огнище, в продължение на 28 дни след умъртвяването на последното болно или серопозитивно за АЧК животно, а след това на всеки три дни в продължение на два месеца, като резултатите се отбелязват в дневник;
ж) извършване на клинични прегледи на еднокопитните животни в населените места, извън епизоотичното огнище, на всеки три дни в продължение на 28 дни след умъртвяване на последното болно или серопозитивно за АЧК животно, като резултатите се отбелязват в дневник;
з) извършване на двукратно серологично изследване на еднокопитните животни в засегнатото населено място през 21 дни;
и) извършване на серологични изследвания в населените места, извън епизоотичното огнище, по схема, утвърдена от генералния директор на НВМС;
к) изграждане на дезинфекционни площадки за хора и транспортни средства пред входовете на обектите с еднокопитни животни;
3. дава указания за обезвреждане на тора и отпадъците от почистването по т. 2, буква "г".
(3) Собствениците на унищожените по ал. 2, т. 2, буква "а" животни се обезщетяват при условията на чл. 40 ЗВД.
(4) Мерките по ал. 2 се отменят 60 дни след унищожаване на последното болно или серопозитивно животно и получени отрицателни резултати за АЧК от двукратни серологични лабораторни изследвания.
(5) След отменяне на мерките по ал. 2 в продължение не по-малко от три месеца, в зависимост от годишния сезон, държавният ветеринарен лекар:
1. извършва:
а) ежеседмични клинични прегледи на еднокопитните животни;
б) дезинсекция, дезинфекция и дератизация на животновъдните обекти;
2. дава указания за обеззаразяване на тора.
Чл. 19. (1) Зона "Б" обхваща територията в радиус не по-малко от 80 км от външната граница на зона "А".
(2) В зона "Б" държавният ветеринарен лекар предприема следните мерки:
1. установява броя на еднокопитните животни в обектите, в които се отглеждат, като данните се отбелязват в дневник;
2. извършва клинични прегледи на еднокопитните животни на всеки три дни в продължение на 28 дни след умъртвяване на последното болно или серопозитивно за АЧК животно, като данните се отбелязват в дневник;
3. забранява:
а) осеменяването, кръвните и други профилактични манипулации на еднокопитните животни;
б) придвижването на еднокопитни животни от обектите, в които те се отглеждат, както и изнасянето на продукти и предмети от тях, които могат да бъдат преносители на вируса на АЧК;
в) пазарите, изложбите и спортните състезания с еднокопитни животни;
4. разрешава извеждане на еднокопитни животни от обектите, в които се отглеждат, само когато животните са предназначени за незабавно клане в кланица, разположена в същата зона и одобрена от НВМС;
5. извършва сондажни серологични изследвания за АЧК по схема, утвърдена от генералния директор на НВМС.
(3) Мерките в зона "Б" се отменят 60 дни след унищожаване на последното болно или серопозитивно за АЧК животно в зона "А" след извършена дезинсекция в засегнатите обекти и получени отрицателни резултати от изследванията по ал. 2, т. 5.
Чл. 20. (1) Зона "В" обхваща територията с радиус не по-малко от 50 км от външната граница на зона "Б", в която не е била извършвана ваксинация по чл. 22, ал. 2 през последните 12 месеца.
(2) В зона "В" държавният ветеринарен лекар предприема мерките по чл. 19, ал. 2.
(3) Ако в зона "В" няма подходяща кланица, еднокопитните животни от тази зона могат да бъдат заклани в кланица в зона "А" или "Б".
(4) Ограничителните мерки в зона "В" се отменят при условията на чл. 19, ал. 3.
Чл. 21. Независимо от наложените мерки по чл. 18, 19 и 20 държавният ветеринарен лекар разрешава придвижване на еднокопитни животни на територията на една зона, когато:
1. животните са прегледани клинично;
2. животните са идентифицирани;
3. при нужда им е извършено серологично лабораторно изследване за АЧК и резултатът от изследването е отрицателен;
4. животните са придружени от ветеринарномедицинско свидетелство за придвижване.
Чл. 22. (1) Забранява се профилактичната ваксинация срещу АЧК в страната.
(2) Принудителна ваксинация срещу АЧК може да се извърши при опасност от широко разпространение на болестта, извън зона "А".
(3) Забранява се принудителна ваксинация срещу АЧК в зона "В".
(4) Ваксинацията по ал. 2 се извършва със заповед на министъра на земеделието и горите по предложение на генералния директор на НВМС. В заповедта се посочва:
1. границите на територията, на която ще се провежда ваксинацията;
2. видовете еднокопитни животни, подлежащи на ваксинация;
3. схемата на ваксинация;
4. начинът на идентификация на ваксинираните животни.
(5) Ваксинираните срещу АЧК животни не могат да излизат от обектите, в които се отглеждат, преди да изминат 60 дни от датата на ваксинация.
Чл. 23. Когато е извършена ваксинация по чл. 22, ал. 2, предприетите мерки по чл. 18, 19 и 20 се изпълняват в продължение най-малко 12 месеца от датата на ваксинацията.
Чл. 24. В зависимост от промените в епизоотичната обстановка мерките за ограничаване и ликвидиране на болестта могат да бъдат изменяни, допълвани или отменяни по реда на тяхното въвеждане.
Допълнителни разпоредби
§ 1. По смисъла на тази наредба:
1. "Еднокопитни животни" са домашни и диви животни от рода "Еквиде".
2. "Африканска чума по конете" е заразно вирусно заболяване по еднокопитните животни, причинявано от орбивирус от семейство "Реовириде", което се характеризира с повишена телесна температура (40 градуса - 41 градуса С), спазматична кашлица, изтечения от ноздрите, зачервяване на конюнктивата, белодробен едем и висока смъртност. Предава се чрез ухапване от кръвосмучещи насекоми от вида "Куликоидес".
3. "Куликоиди (мокреци)" са дребни кръвосмучещи насекоми от род "Куликоиде", семейство "Кератопогониде".
4. "Биотоп" е територия, където протича развитието на ларвите на мокреците.
5. "Серопозитивно животно" е животно, което е изследвано серологично за АЧК и резултатът от изследването е положителен.
6. "Държавен ветеринарен лекар" е ветеринарен лекар от системата на НВМС.
Заключителни разпоредби
§ 2. Тази наредба се издава на основание чл. 23, ал. 2 ЗВД.
§ 3. Наредбата отменя Наредба № 7 от 1999 г. за профилактика и борба с африканската чума по конете (ДВ, бр. 24 от 1999 г.).
§ 4. Изпълнението на наредбата се възлага на генералния директор на НВМС.
Приложение № 1 към чл. 3, ал. 2
Съдържание на оперативния план за действие при съмнение или възникване на болестта АЧК
1. Заповед на генералния директор на НВМС за създаване на Национален координационен център за контрол на мерките за ограничаване и ликвидиране на болестта АЧК.
2. Заповед на директора на РВМС за създаване на регионален координационен център за контрол на мерките по чл. 1, т. 1.
3. Списък на ветеринарномедицинските специалисти с информация за квалификацията и задълженията им при изпълнение на мерките по чл. 1, т. 1.
4. Информация за възможностите на всеки регионален координационен център за незабавно организиране на неговите членове при поява на огнище на АЧК.
5. Списък на моторните превозни средства (регистрационни номера и шофьори), дезинфекционна, дезинсекционна и друга техника, препарати за дезинфекция и дезинсекция, инструменти и оборудване, необходими за провеждане на мерките по чл. 1, т. 1.
6. Инструкции, които посочват последователността на действията при предприемане на мерките по чл. 1, т. 1, включително за начините на обезвреждане на труповете.
7. Програми за обучение на ветеринарномедицинските специалисти, свързани с прилагане на мерките по чл. 1, т. 1.
8. Изисквания към специализираната лаборатория за диагностика на АЧК.
9. Информация за количеството ваксина срещу АЧК, необходима за принудителна ваксинация.
Приложение № 2 към чл. 14, ал. 2
Диагностика на болестта африканска чума по конете
Реактивите за извършване на описаните методи могат да бъдат получени от референтните лаборатории за АЧК от Европейската общност или референтните лаборатории на Международното бюро по епизоотии.
Идентификация на вируса
За идентификацията на вируса на африканската чума по конете се използват следните лабораторни техники и методи - ЕЛАЙЗА за бързо доказване на вируса, използвайки поликлонални (ПКА) и моноклонални (МКА) антитела, полимеразно верижна реакция (PCR) и инокулиране на клетъчни култури и новородени мишлета. Винаги трябва да се правят всички тестове при съмнение за АЧК, като се започне от бързите ЕЛАЙЗА или PCR. Изолирането на вирус върху клетъчни култури и последвалото извършване на вирусно неутрализационна реакция (ВНР) с оглед серотипизирането на щама е необходимо да бъде направено от самото начало на появата на болестта. Най-често в лабораториите се прилага реакция ЕЛАЙЗА за поставяне на бърза диагноза. От изключителна важност при поставянето на диагноза АЧК е правилното вземане и транспортиране на пробите до лабораторията.
Проби за изолиране на вируса
Стабилизирана кръв с антикоагулант, взета по време на температурния стадий на болестта от болните животни, малки парченца (2 - 4 г) от далак, бял дроб и лимфни възли от умрели животни. Пробите се съхраняват и транспортират при 4 градуса С.
1. Клетъчни култури
За изолиране на вируса на АЧК успешно се използват постоянна клетъчна линия от бъбрек на хамстер (BHK 21) и постоянна клетъчна линия от миши бъбрек (VERO). Кръвните проби с хепарин се използват за инокулиране неразредени, като след 60 мин. адсорбция клетките се промиват и се добавя поддържаща среда. При заразяването на клетъчните линии с органни суспензии от далак, бял дроб и лимфен възел те трябва да бъдат 10 %, приготвени с фосфатен буфер (PBS) или клетъчно културална среда, съдържаща антибиотици. При наличие на вирус се поява цитопатичен ефект на клетъчни култури (ЦПЕ) от два до осем дни след заразяването. Задължително се извършват три слепи пасажа преди поставянето на отрицателна диагноза.
2. Новородени мишлета
За изолиране на вируса се използва и интрацеребрално заразяване на 1 - 3-дневни новородени мишлета най-малко от две семейства. При положителна реакция при животните се установяват нервни признаци между 3-тия и 15-ия ден след инокулацията. Мозъкът от всичките мишлета (по семейства) се събира, хомогенизира и инокулира повторно на нови най-малко шест новородени мишлета. При този втори пасаж нервните признаци трябва да се появят по-рано (от 2-рия до 5-ия ден) при 100 % заразяемост.
3. Сандвич ЕЛАЙЗА
Най-малко две ЕЛАЙЗА са разработени за доказване на вирусен антиген от теренни проби или лабораторно заразени клетъчни култури. Едната техника използва поликлонални антитела (ПКА), а другата - моноклонални (МКА), на един и същ основен протеин, който е общ за повечето серотипове на заболяването - VP7. Двата метода могат да се прилагат независимо един от друг, като чрез тях бързо (от 2 до 4 часа) се поставя диагноза АЧК. Реагентите за тези реакции се получават в случай на нужда от Референтната лаборатория за АЧК в Европейския съюз.
3.1. Извършване на ЕЛАЙЗА теста при използването на моноклонално антитяло
3.1.1. Твърда фаза - плаките се натоварват със смес от МКА 5G5 и 3D2, разтворени в PBS съответно 10 ml/ml всяко с последвала инкубация една нощ на 4 градуса С.
3.1.2. След трикратно промиване на плаките с дестилирана вода, съдържаща 0,05 % Tween 20, те внимателно се изтръскват върху адсорбиращ материал до отстраняване на излишната течност в ямките.
3.1.3. Накапва се по 200 ml/на ямка блокиращ разтвор, съдържащ PBS + 1 % говежди серумен албумин (БСА) за един час на 37 градуса С.
3.1.4. Изсипва се внимателно блокиращият разтвор и се изтръскват плаките.
3.1.5. Пробите за изследване (далачни суспензии или клетъчно културална течност) се накапват в неразредено състояние, последвано от две разреждания в PBS+1 % БСА по 100 ml на ямка, с последвала инкубация от 1 час на 37 градуса С. Суспензията от органи (далак, бял дроб, л. възел) се получава, като 2 см около 1 г от органа се хомогенизира в 3 мл MEM (Minimal essential medium) среда, с последвало центрофугиране на 600 g за 10 мин., като се използва супернатантът.
3.1.6. Плаките се промиват трикратно.
3.1.7. Във всяка ямка се накапва конюгат - по 100 ml биотин-макрирано 5G5 МКА, в разреждане 1:500 в PBS+1 %БСА. След инкубиране за един час на 37 градуса С плаките се промиват и се накапва по 100 ml на ямка авидин - пероксидаза в оптимално разреждане в PBS+1 % БСА, с последвал престой 45 мин. на стайна температура.
3.1.8. Плаките се промиват трикратно и в тях се накапва по 200 ml на ямка субстратен разтвор 10 мл 80,6 mM DMAB (dimethyl aminobenzaldehyde) + 10 мл fj 1,56 mM MBTH (3-methyl-2-benzo-thiazolinone hydrazone) + 5 ml H2O2. Цветната реакция се спира чрез прибавяне на 50 ml разтвор на 3N H2SO4 за около 5 - 10 мин., преди отрицателната контрола да започне да се оцветява.
3.1.9. Плаките се отчитат на ридър при 600 или 620 nm.
3.2. Интерпретиране на резултатите
3.2.1. Първо се изчислява cut-off стойността, както следва - С + 0,06 (където С е стойността на отрицателната контрола, 0,6 е стандартното отклонение, получено при група от 30 отрицателни серума).
3.2.2. Пробите, показали стойност, по-ниска от тази, се смятат за отрицателни.
3.2.3. При по-големи стойностти от cut-off + 0,15 се считат за положителни.
3.2.4. Пробите, показали лъжливо положителни резултати, се подлагат отново на изследване за потвърждаване на резултатите
4. Полимеразно верижна реакция
PCR тестът е специфичен за доказване на вирусния РНК на АЧК. Праймерите кореспондират с 5' края / нуклеотиди 1-21/ и в 3' края / нуклеотиди 1160-1179/ от сегмент 8 от РНК на вируса.
Извършване на теста:
От далачна суспензия се екстрахира нуклеиновата киселина, както следва: 1 г от пробата се хомогенизира в 1 мл от денатуриращ разтвор (4 М guanidium thiocyanate, 25 mM sodium citrate, 0,1 M 2-mercaptoethanol, 0,5 % sarcosyl), след което се извършва центрофугиране. Към супернатанта се прибавят 1 mg чиста РНК, 0,1 ml of 2 M sodium acetate pH 4, 1 ml phenol and 0,2 ml chloroform/isoamyl alcohol mixture (49/1), като получената смес внимателно се разбърква в продължение на 15 мин. в баня от лед. Следва отделяне на преципитираната РНК на вируса след фенолна екстракция и преципитация с алкохол. Методът на ДНК синтезата и PCR амплификацията се прилага при 37градуса C. Секвенциите на PCR праймерите използват последователност 5' GTTAAAATTCGGTTAGGATG 3', която винаги кореспондира с поляритета на добавената РНК. Анализът на получения резултат чрез PCR се извършва посредством електрофореза с 1,2 % агаразен гел, съдържащ ethidium bromide.
5. Серологични тестове
Индиректният вариант на ЕЛАЙЗА, използващ разтворим вирус на АЧК или рекомбиниран VP7 протеин за доказване на антитела, се прилага доста често. Имуноблотинг тестът също е адаптиран за доказване на антитела срещу вируса на АЧК. Напоследък приложение намери и ЕЛАЙЗА, използваща неструктурния протеин NS3 за антиген, като тази реакция може да служи при разграничаването на ваксинирани от инфектирани животни. РСК се прилага повсеместно, но при някои серуми не се наблюдава антикомплементарна активност.
5.1. Сравнителна ЕЛАЙЗА за доказване на антитела срещу вируса на африканската чума по конете
Сравнителната ЕЛАЙЗА се използва за доказване на антитела срещу вируса на АЧК в серуми от различни видове и категории еднокопитни. Принципът на реакцията се състои в компететивно свързване на антитела срещу вируса на АЧК. Така реакцията, която протича между антигена и антителата от антиморскосвински серум, се променя при добавяне на серумна проба с наличие на антитела срещу вируса, което визуално се отразява в промяна на оцветяването след прибавяне на ензим. Изследваните серуми могат да бъдат тестирани при единично разреждане 1:5 или да бъдат титрирани за установяване на крайното разреждане. Стойности, по-високи от 50 %, могат да се считат за положителни. Този метод се използва в регионалната референтна лаборатория за АЧК в Пърбрайт, Великобритания.
Извършване на теста
5.1.1. Подготовка на плаките
5.1.1.1. Плаките за ЕЛАЙЗА се натоварват с 100 ml на ямка антиген на вируса АЧК, екстрахиран от клетъчно културална течност и разреден в карбонатно-бикарбонатен буфер с рН 9,6, за една нощ при 4 градуса С.
5.1.1.2. Плаките се промиват трикратно с PBS с рН 7,2 - 7,4, след което се подсушават.
5.1.2. Контролни ямки на плаките
5.1.2.1. Положителните контролни серуми се титрират в двойна серия разреждане, започващи от 1:5 до 1:640, в колона 1 в блокиращ буфер (PBS + 5 % обезмаслено сухо мляко Cadbury's Marvel TM + 0,05 % w/v Tween 20 и 1 % ГСА) до получаване на 50 ml на ямка.
5.1.2.2. Към ямки А и В от колона 2 се добавя 50 ml от отрицателния серум при разреждане 1:5 (10 ml серум + 40 ml блокиращ буфер).
5.1.2.3. В ямки С и D от колона 2 (празна) се добавя 100 ml на ямка блокиращ буфер.
5.1.2.4. В ямки E, F, G и H от колона 2 се накапва 50 ml блокиращ буфер.
5.1.3. Метод за единична титрация:
Прибавя се в разреждане 1:5 серум в блокиращ буфер в колоните от 3 до 12 (10 ml серуми + 40 ml блокиращ буфер).
Или:
5.1.4. Метод на титрацията:
Приготвят се двойни серийни разреждания от 1:5 до 1:640 в блокиращ буфер в осем ямки от единични колони (3 до 12).
След което:
5.1.5. Добавят се 50 ml антисерум от морско свинче, предварително разреден в блокиращ буфер във всички ямки на плаката с изключение на празните (така навсякъде количеството е 100 ml на ямка).
5.1.5.1. Плаките се инкубират за 1 час при 37 градуса С върху орбитален шейкър.
5.1.5.2. Плаките се промиват трикратно, след което се подсушават.
5.1.5.3. Към всяка ямка се прибавя 50 ml конюгат: заешки антиморскосвински пероксидаза, предварително разтворен в блокиращ буфер.
5.1.5.4. Инкубира се в продължение на 1 час при 37 градуса С върху орбитален шейкър.
5.1.5.5. Плаките се промиват трикратно и се подсушават.
5.1.6. Хромоген
Ортофенилендиаминовият разтвор се приготвя според инструкциите (0,4 мг/мл в стерилна дестилирана вода) непосредствено преди употреба. Добавя се субстрат водороден прекис до крайна концентрация 0,05 % v/v (1 към 2000 на 30 % разтвор на Н2О2). Във всяка ямка се накапва по 50 ml от ОФД разтвора, като след 10-минутен престой на стайна температура реакцията се спира чрез прибавяне на ямка 50 ml 1М H2SO4.
5.1.7. Отчитане
Извършва се на ЕЛАЙЗА ридър при дължина на вълната 492 nm.
5.1.8. Интерпретиране на резултатите
5.1.8.1. С помощта на софтуерна програма се отчитат резултатите от оптичната плътност. За валидиране на теста е необходимо горната граница и долната контролна граница на серума от морско свинче да са между 1,4 и 0,4. Крайният титър за положителния контролен серум, базиран на 50 %, трябва да бъде 1:240 в граници от 1:120 до 1:480. Всяка плака, която не отговаря на стандарта, трябва да се изхвърли. Въпреки това, ако при отрицателните серуми титърът е 1:480 и нагоре, те могат да се приемат за отрицателни. Двойните серумни ямки на отрицателната контрола и празните трябва да дават стойности съответно между + 25 % и - 25 % и между + 95 % и + 105 %. При положение че стойностите са извън тези граници, това не означава, че плаката е невалидна, а е признак за оцветяване.
5.1.8.2. Проби, даващи инхибиция повече от 50 %, се считат за положителни. Проби, при отчитането на които стойностите са под 50 %, се считат за отрицателни. При двойните проби, при които се установяват стойности от различните кладенчета под и над 50 %, се считат за съмнителни. Обикновено тези проби се подлагат на повторно изследване. Положителните проби също могат да се титрират с цел да се установи степента на положителност.
5.1.3. Метод за единична титрация
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| + контр. | Тест серуми |
| A | 1:5 | - контр. | ||||||||||
| B | 1:10 | - контр. | ||||||||||
| C | 1:20 | Празен | ||||||||||
| D | 1:40 | Празен | ||||||||||
| E | 1:80 | MC контр. | ||||||||||
| F | 1:160 | MC контр. | ||||||||||
| G | 1:320 | MC контр. | ||||||||||
| H | 1:640 | MC контр. |
| - контр. = отрицателна контрола |
| + контр. = положителна контрола |
| MC контр. = контрола "морскосвински" серум |
5.1.4. Метод на титрация
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| + контр. | Тест серуми |
| A | 1:5 | - контр. | 1:5 | 1:5 | ||||||||
| B | 1:10 | - контр. | 1:10 | 1:10 | ||||||||
| C | 1:20 | Празен | 1:20 | 1:20 | ||||||||
| D | 1:40 | Празен | 1:40 | 1:40 | ||||||||
| E | 1:80 | MC контр. | 1:80 | 1:80 | ||||||||
| F | 1:160 | MC контр. | 1:160 | 1:160 | ||||||||
| G | 1:320 | MC контр. | 1:320 | 1:320 | ||||||||
| H | 1:640 | MC контр. | 1:640 | 1:640 |
| - контр. = отрицателна контрола |
| + контр. = положителна контрола |
| MC контр. = контрола "морскосвински" серум |
5.2. Индиректна ЕЛАЙЗА за доказване на антитела
Тестът използва VP7 протеина като антиген за установяване на антитела срещу вируса на АЧК
5.2.1. Процедура на теста:
5.2.1.1. Твърда фаза
5.2.1.1.1. Плаките се натоварват с рекомбиниран АЧКВ 4 VP7, разреден в карбонатно-бикарбонатен буфер с рН 9,6, след което се инкубират една нощ на 4 градуса С.
5.2.1.1.2. Плаките се промиват петкратно с дестилирана вода, съдържаща 0,01 % Tween20.
5.2.1.1.3. Накапва се по 200 ml / на ямка блокиращ разтвор, съдържащ PBS + 5 % обезмаслено сухо мляко "Нестле", с престой 1 час на 37 градуса С.
5.2.1.1.4. Внимателно се излива блокиращият разтвор и плаките се подсушават.
5.2.1.2. Серумни проби:
5.2.1.2.1. Серумите заедно с положителния и отрицателния серум се разреждат 1:25 в разтвор, съдържащ PBS + 5 % обезмаслено сухо мляко "Нестле" + 0,05 % Tween 20, и се накапват в количество по 100 ml / на ямка с последвала инкубация от 1 час на 37 градуса С. При титрирането се прави двойна серия разреждания в цяла колонка, като същото важи и за положителния и отрицателния серум.
5.2.1.2.2. Плаките се промиват, както е описано в т. 2.
5.2.1.3. Конюгат
5.2.1.3.1. Антиконски глобулин, маркиран с пероксидаза, разреден в разтвор, съдържащ PBS + 5 % обезмаслено сухо мляко "Нестле" + 0,05 % Tween 20 с рН 7,21, се поставя по 100 ml във всяка ямка, с последвала инкубация 1 час на 37 градуса С.
5.2.1.3.2. Плаките се промиват, както е описано в т. 2.
5.2.1.4. Хромоген/субстрат
Във всяка ямка се поставя по 200 ml / на ямка субстратен разтвор (10 мл 80,6 mM DMAB (dimethyl aminobenzaldehyde) + 10 мл fj 1,56 mM MBTH (3-methyl-2-benzo-thiazolinone hydrazone) + 5 ml H2O2). Цветната реакция се спира чрез прибавяне на 50 ml разтвор на 3N H2SO4 за около 5 - 10 мин., преди отрицателната контрола да започне да се оцветява.
5.2.1.5. Плаките се отчитат на ридър при дължина на вълната 600 или 620 nm.
5.2.2. Интерпретиране на резултатите
5.2.2.1. Първо се изчислява cut-off стойността, както следва - С + 0,06 (където С е стойността на отрицателната контрола, 0,6 е стандартното отклонение, получено при група от 30 отрицателни серума).
5.2.2.2. Пробите, показали стойност, по-ниска от тази, се смятат за отрицателни.
5.2.2.3. При по-големи стойности от cut-off + 0,15 се считат за положителни.
5.2.2.4. Пробите, показали лъжливо положителни резултати, се подлагат отново на изследване за потвърждаване на резултатите.
5.3. Блокираща ЕЛАЙЗА за доказване на антитела срещу вируса на АЧК
Чрез метода се доказват специфични антитела срещу вируса на АЧК в серуми от възприемчиви към болестта животни. Основен антиген на реакцията е VP7 протеинът, който е основен за всичките девет серотипа. Този метод се извършва в референтната лаборатория по АЧК на Европейската общност в Алхете, Испания.
5.3.1. ЕЛАЙЗА тест
5.3.1.1. ЕЛАЙЗА плаки
5.3.1.1.1. Плаките се натоварват с рекомбинантен АЧКВ VP7, разреден в карбонатно-бикарбонатен буфер с рН 9,6, с последвала инкубация за една нощ при 4 градуса С.
5.3.1.1.2. Плаките се промиват петкратно с PBS, съдържащ 0,05 % v/v Tween 20 (PBST).
5.3.1.1.3. Плаката се стабилизира със стабилизиращ разтвор, което позволява тя да престоява продължително време на 4 градуса С.
5.3.1.2. Контроли със серумни проби
5.3.1.2.1. Скрининг тест серумите и контролите се разреждат в PBST 1:10 директрон върху плаката до получаване на краен обем 100 ml/на ямка, с последвала инкубация от 1 час при 37 градуса С.
5.3.1.2.2. Титрация: приготвя се двойна серия разреждане на тестираните серуми и положителните контроли (100 ml/на ямка от 1:10 до 1:280). Отрицателните контроли се разреждат 1:10.
5.3.1.3. Конюгат
Добавя се по 50 ml/на ямка предварително разреден моноклонално антитяло срещу VP7, маркирано с пероксидаза, като след хомогенизиране и разбъркване престоява 30 мин. при 37 градуса С.
5.3.1.4. Плаките се промиват петкратно с PBST и се подсушават.
5.3.1.5. Хромоген/субстрат
Прибавят се по 100 ml/на ямка хромоген/субстратен разтвор (1мл ABTS (2,2'-Azino-bis-[3-етилбензотиазолин-6-sulphuric acid]) 5 mg/ml + 9 ml субстратен разтвор / 0,1 M фосфатно-цитратен буфер с рН 4, съдържащ 0,03 % H2O2/ и се инкубира в продължение на 10 мин. на стайна температура. Оцветяването се спира чрез прибавяне на 100 ml/на ямка 2 % (w/v) SDS (sodium dodecyl sulphate).
5.3.1.6. Отчитане
Извършва се посредством ЕЛАЙЗА ридър при дължина на вълната 405 nm.
5.3.2. Интерпретиране на резултатите.
5.3.2.1. Валидност на теста
Той е валиден, когато оптичната плътност на отрицателната контрола (ОК) е по-висока от 1,0, а тази на положителната контрола (ПК) е по-ниска от 0,2.
5.3.2.2. Изчисляване на пределните стойности:
положителна стойност (ПК) - ОК - (ОК - ПК) ґ 0,3;
отрицателна стойност (ОК) - ОК - (ОК - ПК) ґ 0,2,
където ОК е екстинцията на отр. контрола, а ПК - на положителната.
5.3.2.3. Интерпретиране на резултатите
Проби с екстинция, по-ниска от положителната стойност, се считат за положителни за антитела срещу АЧКВ.
Проби с екстинция, по-висока от отрицателната стойност, се считат за отрицателни за антитела срещу АЧКВ.
Проби с екстинция между тези две стойности се считат за съмнителни, като две до три седмици след това се вземат нови кръвни проби от същите животни и се подлагат отново на изследване с теста.
5.4. Имуноблотинг тест
Свързването на антитела с вирусни протеини, разделени при електрофореза и след това прехвърлени върху нитроцелулозна мембрана, също се прилага като метод за доказване на антитела срещу вируса на АЧК.
5.4.1. Тест процедура
Полупречистените протеини от вируса на АЧК се разделят с помощта на SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis) в 15 % acrylamide-N,N'-diallytartar-diamide (DATD) гел. Така разделените протеини се трансферират върху нитроцелулозни мембранни филтри при постоянен ток със сила 280 mA за 6 часа при 4 градуса С. Нитроцелулозните мембрани се изрязват и се обработват с тестираните серуми в разреждане 1:20, след това с конюгат, маркиран с пероксидаза заешки антиконски имуноглобулин - 1:500, и се инкубира за 1 час на 37 градуса С. Оцветяването на бендовете се извършва посредством 4-хлор - нафтол техника.
5.4.2. Интерпретиране на резултатите
Сравняват се бендовете на положителната и отрицателната контрола с тези на изследваните серуми. Появата на повече от два бенда показва, че серумът е положителен за наличие на антитела срещу вируса на АЧК.
5.5. ЕЛАЙЗА срещу неструктурните протеини на вируса (NS3 ЕЛАЙЗА)
Тази реакция се използва, за да може да се различават антитела, получени вследствие на ваксинация с AHSV-4, и такива, които са инфектирани с вирулентен вирус.
5.6. Реакция за свързване на комплемента (РСК)
РСК се използва с оглед установяването на групово специфични антикомплементални антитела срещу вируса на АЧК. Най-често като антиген се използва захарно-ацетонов екстракт от миши мозък. При отсъствие на стандартизин серум антигенът се титрира срещу местен положителен серум. За контролен антиген служи миши мозък, получен по същия начин от здрави мишки.
Серумите от коне трябва да бъдат инактивирани на 56 градуса С, серумите от зебри на 60 градуса С, а от магарета на 62 градуса С за 30 мин. Тестираните серуми се разреждат 1:10 и се инактивират по посочения начин. Титрацията на положителните контроли се извършва в двукратни разреждания. Антигените - положителен и контролен, се разреждат в буфер, съдържащ 4 - 8 антигенни единици във veronal buffered saline, съдържащ 1 % gelatin (VBSG); морскосвинският комплемент се разрежда във VBSG до 4 CH50 (50 % complement haemolytic units). Серумите, комплементът и антигенът се свързват поставени в 96-ямкови плаки с равно дъно или в епруветки, поставени на 4 градуса C за 18 часа. Хемолизинът се разрежда в реакцията до 2 хемолитични единици и се употребява заедно с промити овчи еритроцити. Еритроцитите се стандартизират до 3 % концентрация и се добавят в ямките. Реакцията продължава с инкубация за 30 мин. на 37 градуса C. Плаките се центрофугират на 200 g и се отчита наличието на хемолиза. За контроли служат: (а) серум и комплемент (b) серум и еритроцити (c) антиген и контролен, всеки с 4 CH50, 2 CH50, and 1 CH50 от комплемента (d) антиген с еритроцити (e) контролен антиген с еритроцити (f) разреждания на комплемента от 4 CH50, 2 CH50, and 1 CH5 и (g) еритроцити. Титърът се определя от най-високото разреждане на серум, фиксирано от комплемента с положителния антиген. Така титър в разреждане от 1/10 се счита за положителен, а под 1/10 - за отрицателен.
5.7. Реакция вирус неутрализация (ВНР)
ВНР се използва се определяне на серотипа.
Вирусният антиген се разрежда до 30 - 100 TCID50 (50 % tissue culture infective dose) за 25 ml и 25 ml се прибавя във всяка епруветка, съдържаща 25 ml серумни разреждания. При скирингови изследвания се използва разреждане на серума до 1:10.
Сместа от серум с вирус се инкубира за 60 минути при 37 градуса C преди добавяне на 0,1 ml от VERO клетъчна суспензия (200,000 клетки/ml)във всяка епруветка.
При титрация вирусният антиген се приготвя за тестване на четири разреждания по 25 ml на ямка. Плаките се инкубират на 37 градуса C, 5 % CO2, 95 % влажност за 4 - 5 дни, при съдържание на вирус 30 - 100 TCID50.
Плаките се фиксират и оцветяват с разтвор на 0,15 % crystal violet in 2 % glutaraldehyde, след което се промиват.
За 50 % крайна точка на титъра на серума се изчислява по метода на Spearman-Kдrber и се определя отрицателният log10.
Приложение № 3 към чл. 18, ал. 2, т. 2, буква "в"
Правила за дезинсекция при африканска чума по конете
При извършване на дезинсекцията се цели унищожаване на векторите (преносителите) на болестта АЧК. Тя включва следните мерки:
1. Мерки срещу преимагиналните стадии на развитие на мокреците:
а) премахване на биотопите за развитие на ларвите на мокреците чрез отводняване на водоемите със застояла вода (блата, мочурища, канавки, вирове и др.);
б) обработване на биотопите, неподдаващи се на мелиорация, с одобрени от НВМС ларвицидни средства на всеки 10 - 14 дни от април до октомври.
2. Мерки за унищожаване на възрастните мокреци:
а) унищожаване на мокреците в откритото пространство в радиус 5 - 10 км от епизоотичното огнище чрез опръскване с авиотехника по метода "ултранисък обем" или чрез използване на топъл или студен аерозол и димни шашки - извършва се привечер, нощем или рано сутрин през 10 - 14 дни;
б) унищожаване на влетелите в помещенията мокреци чрез опръскване, димни шашки или обгазяване с топъл или студен аерозол при отсъствието на животните.
3. Мерки за предотвратяване влитането на мокреците в помещенията:
а) замрежване на прозорците със ситна мрежа (сечение 1 мм2) и поставяне на допълнителни летящи входни врати от същата мрежа;
б) обработка на помещенията отвън с одобрени от НВМС инсектицидни препарати през 10 дни.
4. Мерки за предпазване от ухапване на еднокопитните животни от мокреци чрез третиране на животните с подходящи инсектицидни препарати.
