Държавен вестник, брой 91 от 25.IX

Приложение № 9 към чл. 9а

Химични методи за проверка състава на козметичните продукти

I. Вземане на проби от козметични продукти

1. Област на приложение

Процедурата за вземане на проби от козметични продукти е описана от гледна точка на техния анализ в различни лаборатории.

2. Дефиниция

2.1. Основна (базисна) проба - единица, взета от партида, предложена за продажба.

2.2. Обща проба - сума от всички основни проби, имащи един и същ партиден номер.

2.3. Лабораторна проба - представителна част от общата проба, която се анализира в отделните лаборатории.

2.4. Част от пробата за изпитване (тест-порция) - типична част от лабораторната проба, която се изисква за един анализ.

2.5. Опаковка - артикулът, който съдържа продукта и е в непрекъснат директен контакт с него.

3. Изисквания при подбора на проби

3.1. Проба от козметичните продукти се взема в тяхната оригинална опаковка. Пробите се предават в аналитичната лаборатория затворени.

3.2. За козметични продукти, които се представят на пазара в насипно състояние или се доставят на дребно в опаковка, различна от оригиналната опаковка на производителя, трябва да се издаде подходяща инструкция за вземане на проба на мястото на използване или на мястото за продажба.

3.3. Броят основни (базисни) проби, необходим за приготвяне на лабораторна проба, се определя чрез аналитичния метод и броя на анализите, изпълнени от всяка лаборатория.

4. Идентификация на пробата

4.1. След като се вземат, пробите се затварят и идентифицират съгласно правилата за вземане на проби.

4.2. Всяка взета и идентифицирана основна проба се маркира със следната информация:

- наименование на козметичния продукт;

- дата, време и място на вземане на пробата;

- името на лицето, отговорно за вземане на пробата;

- наименование на контролното звено.

4.3. За вземането на пробата се съставя протокол.

5. Съхранение на пробата

5.1. Основните (базисните) проби се съхраняват в съответствие с посочените инструкции на производителя върху етикета, ако има такъв.

5.2. Ако няма други специфицирани условия, лабораторните мостри се съхраняват на тъмно между 10 и 25 °С.

5.3. Базисните проби не се отварят до започване на анализа.

II. Лабораторно приготвяне на частта от пробата за изпитване

1. Обща част

1.1. Когато е възможно, се анализира всяка базисна проба. Ако базисната проба е много малка, се използва минималният брой базисни проби. Пробите трябва да са смесени много добре, преди да се вземе частта от пробата за изпитване.

1.2. Опаковката се отваря под инертен газ, ако така е препоръчано в аналитичния метод, и се изтегля необходимата част от пробата за изпитване възможно най-бързо. След това анализът продължава с възможно най-малко забавяне. Ако пробата трябва да се запази, опаковката отново се затваря под инертен газ.

1.3. Козметичните продукти могат да са приготвени в течно, твърдо или полутвърдо състояние. Ако настъпи разслоение в хомогенен продукт, той отново се хомогенизира, преди да се вземе част от пробата за изпитване.

1.4. Ако козметичният продукт се предлага за продажба по специален начин, поради което той не може да се третира в съответствие с тези инструкции, и ако няма направена уговорка за съответни методи за изследване, може да се възприеме оригинална процедура, при условие че се представи в писмен вид като част от доклада от анализа.

2. Течности

2.1. Те могат да се представят под формата на продукти като разтвори в масло, в алкохол, във вода, тоалетни води, лосиони или млека и може да са поставени във флакони, бутилки, ампули или туби.

2.2. Изтегляне на част от пробата за изпитване:

- опаковката с пробата енергично се разклаща, преди да се отвори;

- опаковката се отваря;

- отсипват се няколко милилитра от течността в епруветка за визуално изследване;

- опаковката се затваря отново, или

- взема се необходимото количество за изпитване;

- опаковката се затваря внимателно.

3. Полутвърди продукти

3.1. Това са продукти като пасти, кремове, емулсии, гъсти емулсии и гелове, напълнени в туби, пластмасови флакони или буркани.

3.2. Изтегляне на част от пробата за изпитване от:

3.2.1. опаковки с тесни отвори - отстранява се най-малко първият сантиметър от продукта; изстисква се порцията и опаковката веднага се затваря;

3.2.2. съдове с широки гърла - повърхностният слой се отстранява равномерно; взема се частта от пробата за изпитване и опаковката веднага се затваря.

4. Твърди продукти

4.1. Такива по отношение на формата са некомпактните пудри, компактните пудри, щифтовете. Те могат да са поставени в най-разнообразни опаковки.

4.2. Вземане на част от пробата за изпитване от:

4.2.1. некомпактна пудра - разбърква се енергично, преди да се отвори; отваря се и се взема частта от пробата за изпитване;

4.2.2. компактна пудра или щифт - повърхностният слой се отстранява чрез равномерно изгребване; взема се част от пробата за изпитване от вътрешността.

5. Продукти в опаковки под налягане (аерозолни опаковки)

5.1. Вземане на част от пробата за изпитване

След енергично разклащане аликвотна част от съдържанието на аерозолната опаковка се прехвърля с помощта на подходящо свързващо устройство в стъклен флакон с пластмасово покритие (фиг. 1), снабден с аерозолен вентил, но без шлаух (сифонна тръбичка).

Фиг. 1. Преливен флакон с вместимост 50 до 100 ml

Примерна схема на свързващо устройство е показана на фиг. 2, но при специфични изисквания на аналитичния метод могат да се използват и други. По време на прехвърлянето флаконът се държи с вентила надолу. Така съдържанието се вижда ясно. Възможни са следните четири случая:

Фиг. 2. Свързващо устройство (конектор) - Р1

5.1.1. аерозолен продукт под формата на хомогенен разтвор за директен анализ;

5.1.2. аерозолен продукт, състоящ се от две фази; всяка фаза може да се анализира, след като долната фаза се отдели във втори преливен флакон; тя предимно е водна и без съдържание на пропелант;

5.1.3. аерозолен продукт, съдържащ прахообразна съставка в суспензия; течната фаза може да се анализира след отстраняване на прахообразната съставка;

5.1.4. продукт под форма на пяна или крем.

В преливния флакон се отмерва точно измерено количество (между 5 и 10 g) 2-метоксиетанол. Последният предпазва от образуване на пяна по време на дегазирането и тогава е възможно да се отстрани пропелантът без загуба на течност.

5.2. Спомагателни приспособления

Свързващото устройство - конектор (фиг. 2), е от дуралуминий или от месинг. Конструкцията му е пригодна за различни вентилни системи чрез полиетиленов адаптор. Могат да се използват и други свързващи устройства (виж фиг. 3 и 4).

Фиг. 3. Свързващо устройство (конектор) - М2

Фиг. 4. Свързващо устройство (конектор) - М1

Преливният флакон (фиг. 4) е изготвен от бяло стъкло, обвито от външната страна с предпазен слой от прозрачен пластмасов материал. Обемът му е от 50 до 100 cm3 (ml). Снабден е с аерозолен вентил без сифонна тръбичка.

5.3. Процедура

За да се прехвърли достатъчно количество проба, преливният флакон не трябва да съдържа въздух. За тази цел чрез конектора се вкарват около 10 cm3 (ml) дихлордифлуорометан или бутан (в зависимост от вида на изследвания аерозолен продукт) и напълно се обезгазява. Свързващото устройство се отстранява. Претегля се преливната бутилка ("а" g). Енергично се разклаща аерозолната опаковка, от която ще се взема пробата. Прикачва се конекторът към вентила на аерозолната опаковка, от която ще се взема пробата (вентилът е нагоре), приспособява се преливният флакон (гърлото надолу) към конектора и се натиска. Напълва се преливният флакон до 2/3. Ако прехвърлянето се прекрати поради уеднаквяване на налягането, то може да се възстанови чрез охлаждане на преливния флакон.

Отстранява се конекторът, претегля се напълненият флакон ("b" g) и се определя теглото на прехвърлената аерозолна проба М1 (М1=b - a).

Така получената проба може да се използва за:

- химичен анализ;

- анализ на летливи съставки чрез газова хроматография.

5.3.1. Подготовка на пробата за химичен анализ

Държейки преливния флакон с вентил нагоре, се извършват следните операции:

- дегазиране; ако дегазирането доведе до образуване на пяна, се използва преливен флакон, в който предварително се поставя точно претеглено количество (между 5 и 10 g) 2-метоксиетанол, въведен във флакона чрез конектора със спринцовка;

- завършва се отстраняването на летливите съставки без загуба чрез разбъркване на пробата на водна баня при поддържане на температурата 40 градуса С; откачва се конекторът;

- претегля се отново преливният флакон ("с" g), за да се определи теглото на остатъка М2 (М2 = c - a).

Когато се изчислява теглото на остатъка, се изважда теглото на използвания 2-метоксиетанол;

- отваря се преливният флакон чрез отстраняване на вентила;

- разтваря се напълно остатъкът в известно количество подходящ разтворител;

- извършва се необходимото определяне на аликвотната част.

Формулите за изчисление са:

	r x M2		R x P
R =	__________________	Q =	______,
	M1		100

където: М1 e масата на аерозола, взет в преливния флакон, в g;

M2 - масата на остатъка след загряване до 40 градуса С в g;

r - специфичното вещество в M2 в % (определено съгласно подходящ метод);

R - специфичното вещество в аерозола в %, както е получен;

Q - общата маса на специфичното вещество в аерозолната опаковка в g;

P - нетната маса на първоначалната аерозолна опаковка (основна проба) в g.

5.3.2. Подготовка на пробата за анализ на летливите съставки чрез газова хроматография:

5.3.2.1. принцип - с газхроматографска спринцовка се изтегля подходящо количество проба от преливния флакон, което се инжектира в газовия хроматограф;

5.3.2.2. спомагателни приспособления - газхроматографска спринцовка (с точност на пробовземането серия А2) от 25 ml или 50 ml (фиг. 5) или еквивалентна; тази спринцовка е снабдена с ограничител в края на иглата. Спринцовката се свързва към преливния флакон чрез конектор и чрез полиетиленова тръбичка (дължина 8 mm, вътрешен диаметър 2,5 mm);

Фиг. 5. Газхроматографска спринцовка

5.3.2.3. процедура - от преливния флакон, в който е прехвърлено необходимото количество продукт, съгласно т. 5.3 се взема проба с газхроматографска спринцовка; последната се свързва с преливния флакон, както е описано в 5.3.2.2; отваря се вентилът и се изтегля необходимият обем; газовите мехурчета се отстраняват чрез раздвижване на буталото, при което иглата на спринцовката е насочена вертикално нагоре; ако е необходимо, спринцовката се охлажда; когато спринцовката се напълни с необходимото количество проба без мехурчета, вентилът се затваря и спринцовката се отстранява от преливния флакон; иглата на спринцовката се вкарва в инжектора на газовия хроматограф, вентилът се отваря и пробата се инжектира;

5.3.2.4. вътрешен стандарт - ако се изисква вътрешен стандарт, той се въвежда в преливния флакон посредством обикновена стъклена спринцовка с помощта на конектор.

III. Определяне и индентификация на свободните натриеви и калиеви хидроксиди

1. Област на приложение

Методът се отнася за идентификация на козметични продукти, съдържащи значителни количества свободни натриеви и/или калиеви хидроксиди и за определянето на такива свободни натриеви и/или калиеви хидроксиди в препарати за заздравяване на косата и препарати за разтваряне на кожичките около ноктите.

2. Дефиниция

Свободните натриеви и калиеви хидроксиди се определят чрез обема на стандартна киселина, необходима за неутрализирането на продукта при определени условия, като резултатът се изразява в % (М/М) свободен натриев хидроксид.

3. Принцип

Пробата се разтваря или разпръсква във вода и се титрува със стандартна киселина. Стойността на рН се записва успоредно с прибавянето на киселината: за прост разтвор на натриеви или калиеви хидроксиди крайната точка е ясно изразената максимална степен на промяната на записаната рН стойност.

Кривата на простото титруване може да се повлияе от присъствието на:

- амоняк и други слаби органични основи, които имат доста равна крива на титруване; амонякът се отстранява чрез изпаряване при намалено налягане и стайна температура;

- соли на слаби киселини, които могат да създадат много различни точки на инфлексия на кривата на титруване; в такива случаи само първата част на кривата до първите точки на инфлексия отговаря на неутрализацията на хидроксилния йон, идващ от свободния натриев или калиев хидроксид; представена е алтернативна процедура за титруване в алкохол, където се означава прекомерната интерференция от солите на слаби неорганични киселини.

Съществува теоретична възможност, че други разтворими силни основи, напр. литиев хидроксид, четвъртичен амониев хидроксид, могат да присъстват, причинявайки високо рН, присъствието им в този вид козметичен продукт е твърде невероятно.

4. Идентификация

4.1. Реактиви - стандартен алкален буферен разтвор рН - 9,18 при 25 градуса C: 0,05 М натриев борат тетрахидрат.

4.2. Апаратура:

4.2.1. стандартно лабораторно оборудване;

4.2.2. рН метър;

4.2.3. стъклен мембранен електрод;

4.2.4. стандартен каломелов референтен електрод.

4.3. Процедура - калибрира се рН метърът с електродите, като се използва стандартният буферен разтвор. Приготвя се 10 % воден разтвор или дисперсия на продукта, който ще се анализира, и се филтрува. Измерва се рН. Ако рН е 12 или повече, трябва да се осъществи количествено определяне.

5. Определяне

5.1. Титруване във водна среда

5.1.1. Реактиви - стандартна 0,1 N солна киселина

5.1.2. Апаратура:

5.1.2.1. стандартно лабораторно оборудване;

5.1.2.2. рН метър, за предпочитане със записващо устройство;

5.1.2.3. стъклен мембранен електрод;

5.1.2.4. стандартен каломелов референтен електрод.

5.1.3. Процедура - претеглят се между 0,5 и 1,0 g с точност 0,001 g от пробата за изпитване в 150 cm3 (ml) колба. Ако има амоняк, се прибавят няколко гранули против кипенето и се изпарява под вакуум, използвайки водна помпа, докато престане да се усеща миризмата на амоняк (около 3 h). Остатъкът се разтваря със 100 cm3 (ml) дестилирана вода и се титрува с 0,1 N разтвор на солна киселина (5.1.1), записвайки промяната на рН (5.1.2.2).

5.1.4. Изчисление - идентифицират се точките на инфлексия върху кривите на титруване. Където се появи първата точка на инфлексия при рН под 7,0, там пробата е свободна от натриев или калиев хидроксид. Където има две или повече точки на инфлексия в кривата, само първата е валидна. Отбелязва се обемът на титранта при първата точка на инфлексия.

Съдържанието на натриев и/или калиев хидроксид (С) в пробата, изразено като % (М/М) натриев хидроксид, се изчислява по формулата:

	V
C% = 0,4	___,
	M

където:

V е обемът на титранта в cm3 (ml);

M - теглото на пробата в g.

Възможно е въпреки означенията за присъствие на значително количество натриев и/или калиев хидроксид кривата на титруване да не покаже точката на инфлексия. В такъв случай определянето се повтаря в изопропанол.

5.2. Титруване в изопропанол

5.2.1. Реактиви:

5.2.1.1. изопропанол;

5.2.1.2. 1,0 N стандартен воден разтвор на солна киселина;

5.2.1.3. 0,1 N солна киселина в изопропанол, приготвена непосредствено преди употреба чрез разреждане на 1,0 N воден разтвор на солна киселина с изопропанол.

5.2.2. Апаратура:

5.2.2.1. стандартно лабораторно оборудване;

5.2.2.2. рН метър, за предпочитане със записващо устройство;

5.2.2.3. стъклен мембранен електрод;

5.2.2.4. стандартен каломелов референтен електрод.

5.2.3. Процедура - претеглят се между 0,5 и 1,0 g с точност 0,001 g от пробата за изпитване в 150 cm3 (ml) колба. Ако има амоняк, се прибавят няколко гранули против кипенето и се изпарява под вакуум, използвайки водна помпа, докато престане да се усеща миризмата на амоняк (около 3 h).

Остатъкът се разтваря със 100 cm3 (ml) изопропанол и се титрува с 0,1 N солна киселина в изопропанол (5.2.1.1), записвайки промяната в рН (5.2.2.2).

5.2.4. Изчисление - както в 5.1.4 първата точка на инфлексия е при рН около 9,0.

5.3. Повторяемост (виж ISO 5725)

За съдържание на натриев или калиев хидроксид до 5 % (M/M) като натриев хидроксид разликата между резултатите от две определения, осъществени паралелно върху една и съща проба, не трябва да превишава абсолютната стойност от 0,25 %.

IV. Определяне и идентификация на оксалова киселина и нейните алкални соли в продукти за поддържане на косата

1. Област на приложение

Методът се отнася за определяне и идентификация на оксалова киселина и нейните алкални соли в продукти за поддържане на косата. Той може да се използва за безцветни водно/алкохолни разтвори и лосиони, които съдържат около 5 % оксалова киселина или еквивалентно количество алкален оксалат.

2. Дефиниция

Съдържанието на оксалова киселина и/или нейните алкални соли, определено по този метод, се изразява като % (M/M) свободна оксалова киселина в пробата.

3. Принцип

След отстраняването на всякакви анионни повърхностноактивни вещества с р-толуидин хидрохлорид оксаловата киселина и/или оксалатите се утаяват като калциев оксалат, след което разтворът се филтрува. Утайката се разтваря в сярна киселина и се титрува с калиев перманганат.

4. Реактиви

Всички реактиви трябва да бъдат с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.

4.1. Разтвор на амониев ацетат - 5 % (М/М)

4.2. Разтвор на калциев хлорид - 10 % (М/М)

4.3. Етанол - 95 % (V/V)

4.4. Тетрахлорметан

4.5. Диетилов етер

4.6. Разтвор на р-толуидин дихидрохлорид - 6,8 % (М/М)

4.7. Калиев перманганат - 0,1 N разтвор

4.8. Сярна киселина - 20 % (М/М)

4.9. Солна киселина - 10 % (М/М)

4.10. Натриев ацетат трихидрат

4.11. Ледена оцетна киселина

4.12. Сярна киселина (1:1)

4.13. Наситен разтвор на бариев хидроксид

5. Апаратура

5.1. Делителни фунии - 500 cm3 (ml)

5.2. Стъклени чаши - 50 cm3 (ml) и 600 cm3 (ml)

5.3. Стъклени филтри - G-4

5.4. Мерителни цилиндри - 25 cm3 (ml) и 100 cm3 (ml)

5.5. Пипети - 10 cm3 (ml)

5.6. Смукателни колби - 500 cm3 (ml)

5.7. Водоструйна помпа

5.8. Термометър - градуиран от 0 до 100 градуса С

5.9. Магнитна бъркалка с нагревател

5.10. Магнитни разбъркващи пръчки - покрити с тефлон

5.11. Бюрета - 25 cm3 (ml)

5.12. Конусни колби - 250 cm3 (ml)

6. Процедура

6.1. Претеглят се 6 до 7 g от пробата с точност 0,001 g в 50 cm3 (ml) стъклена чаша, довежда се рН до 3,0 с разредена солна киселина (4.9) и се прехвърля в делителна фуния със 100 cm3 (ml) дестилирана вода. Добавят се последователно 25 cm3 (ml) етанол (4.3), 25 cm3 (ml) разтвор на р-толуидин дихидрохлорид (4.6) и 25 до 30 cm3 (ml) тетрахлорметан (4.4) и сместа се разклаща енергично.

6.2. След разделянето на фазите долната (органична) фаза се отстранява, повтаря се екстракцията, като се използват реактивите, посочени в 6.1, и отново се отстранява органичната фаза.

6.3. Водният разтвор се прехвърля в 600 cm3 (ml) стъклена чаша и се отстранява останалият тетрахлорметан чрез кипене на разтвора.

6.4. Добавят се 50 cm3 (ml) разтвор на амониев ацетат (4.1), довежда се разтворът до кипене (5.9) и се добавя при разбъркване 10 cm3 (ml) горещ разтвор на калциев хлорид (4.2). Оставя се да се отдели утайката.

6.5. Проверява се дали е завършено утаяването чрез прибавяне на няколко капки разтвор на калциев хлорид (4.2), оставя се да изстине на стайна температура и се разбърква с 200 cm3 (ml) етанол (4.3) с помощта на разбъркващи пръчки (5.10) и се оставя се да престои 30 min.

6.6. Течността се филтрува през стъклен филтър (5.3), утайката се пренася с малко количество гореща вода (50 до 60 градуса С) във филтъра и се промива със студена вода.

6.7. Утайката се промива пет пъти с малко етанол (4.3) и след това пет пъти с малко диетилов етер (4.5). Утайката от стъкления филтър се прехвърля върху друга смукателна колба и се разтваря с 50 cm3 (ml) гореща сярна киселина (4.8) при изсмукване под вакуум.

6.8. Разтворът се пренася в конусна колба (5.12) и се титрува с разтвор на кaлиев перманганат (4.7) до леко розово оцветяване.

7. Изчисления

Съдържанието на оксалова киселина в пробата (С), изразено като % (M/M), се изчислява по формулата:

	A x 4,50179 x 100
C %=	_________________,
	M x 1000

където:

А е изразходваното количество 0,1 N калиев перманганат при титруването (6.8) в сm3;

M - масата на пробата в g (6.1);

4,50179 - коефициент на превръщане за оксалова киселина.

8. Повторяемост (виж ISO 5725)

За съдържание на оксалова киселина до 5 % разликата между резултатите от две определения, осъществени паралелно върху една и съща проба, не трябва да превишава абсолютната стойност от 0,15 %.

9. Идентификация

9.1. Принцип

Оксаловата киселина и/или нейните оксалати се утаяват като калциев оксалат и се разтварят в сярна киселина. Към разтвора се прибавя разтвор на калиев перманганат, който се обезцветява и причинява образуването на въглероден диоксид. Когато въглеродният диоксид преминава през разтвор на бариев хидроксид, се образува млечнобяла утайка от бариев карбонат.

9.2. Процедура

9.2.1. Част от пробата, която ще се анализира, се обработва, както е описано в точки от 6.1 до 6.3, така че да се отстранят всякакви налични детергенти.

9.2.2. Към 10 cm3 (ml) от разтвора, получен в съответствие с 9.2.1, се добавя шпатула с натриев ацетат (4.10) и разтворът се подкиселява с няколко капки студена оцетна киселина (4.11).

9.2.3. Добавя се 10 % разтвор на калциев хлорид (4.2) и се филтрува.

Утайката от калциев оксалат се разтваря в 2 cm3 (ml) сярна киселина (1:1) (4.12).

9.2.4. Разтворът се пренася в колбата за изпитване и се добавят на капки 0,5 cm3 (ml) 0,1 N разтвор на калиев перманганат (4.7). Ако има оксалат, разтворът се обезцветява първо постепенно, а след това бързо.

9.2.5. Веднага след добавянето на калиевия перманганат върху колбата се поставя подходящ крюмер, нагрява се леко и образуваният въглероден диоксид се събира в наситен разтвор на бариев хидроксид (4.13). Появата на млечен облак от бариев карбонат след 3 до 5 min показва присъствие на оксалова киселина.

V. Определяне на хлороформ в пасти за зъби

1. Област на приложение

Този метод се отнася за определяне на хлороформ в пасти за зъби чрез газова хроматография в концентрация до 5 %.

2. Дефиниция

Съдържанието на хлороформ, определено с този метод, се изразява като % (M/M).

3. Принцип

Пастата за зъби се суспендира в смес от диметилформамид/метанол, към която се добавя известно количество ацетонитрил като вътрешен стандарт.

След центрофугиране част от течната фаза се хроматографира и се изчислява съдържанието на хлороформ.

4. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.).

4.1. Porapak Q, Chromosorb 101 или еквивалентни, 80 до 100 mesh

4.2. Ацетонитрил

4.3. Хлороформ

4.4. Диметилформамид

4.5. Метанол

4.6. Разтвор на вътрешен стандарт

В мерителна колба от 50 cm3 (ml) се отпипетират 5 сm3 (ml) диметилформамид (4.4) и се добавят около 300 mg (M) ацетонитрил, претеглен с точност 1 mg. Долива се до марката с диметилформамид и се разбърква.

4.7. Разтвор за определяне на относителния отговор на сигнала

В мерителна колба от 10 cm3 (ml) се отпипетират точно 5 cm3 (ml) вътрешен стандартен разтвор (4.6) и се добавят около 300 mg (M1) хлороформ, претеглен с точност 1 mg. Долива се до марката с диметилформамид и се разбърква.

5. Апаратура

5.1. Аналитична везна

5.2. Газов хроматограф с пламъчно йонизационен детектор

5.3. Микроспринцовка с вместимост от 5 до 10 ml и деления от 0,1 ml

5.4. Пипети с вместимост 1, 4 и 5 cm3 (ml)

5.5. Мерителни колби - 10 и 50 cm3 (ml)

5.6. Шишенца за изпитване, приблизително 20 cm3 (ml), с капачки на винт, Sovirel France N20 или еквивалентни. Капачката на винт има вътрешно уплътнение за запечатване, покрито само от едната страна с тефлон.

5.7. Центрофуга

6. Процедура

6.1. Подходящи газхроматографски условия

6.1.1. Материал за колоната: стъкло

дължина - 150 cm

вътрешен диаметър - 4 mm

външен диаметър - 6 mm

6.1.2. Пълнеж на колоната: Porapak Q, Chromosorb 101 или еквивалентни, с 80 до 100 меша (4.1), киселинно обработени.

6.1.3. Пламъчно йонизационен детектор: чувствителността му се нагласява така, че когато се инжектират 3 ml oт разтвор 4.7, височината на ацетонитриловия пик да бъде три четвърти от височината на цялата скала.

6.1.4. Газове:

Носител - азот, със скорост на потока 65 cm3 (ml)/min.

Допълнителни газове: потокът от газове към детектора се нагласява така, че потокът от въздух или кислород да е 5 до 10 пъти повече от този на водорода.

6.1.5. Температури:

на инжекторния блок - 210 градуса С

на детекторния блок - 210 градуса С

на колонната пещ - 175 градуса С

6.1.6. Скорост на диаграмата - около 100 cm/h.

6.2. Подготовка на пробата

Пробата за анализ се взема от неотворена туба. Отстранява се една трета от съдържанието, поставя се отново капачката на тубата, смесва се внимателно съдържанието, след което се взема пробата за изпитване.

6.3. Определяне

6.3.1. В шишенце с капак на винт (5.6) се претеглят 6 до 7 g (M0) с точност 0,001 g от пастата за зъби, приготвена в съответствие с 6.2, и се прибавят три малки стъклени перли.

6.3.2. В шишенцето се отпипетирват точно 5 cm3 (ml) разтвор на вътрешен стандарт (4.6), 4 cm3 (ml) диметилформамид (4.4) и 1 cm3 (ml) метанол (4.5). Шишенцето се затваря и разбърква.

6.3.3. Затвореното шишенце се разклаща за половин час на механична клатачна машина и се центрофугира за 15 min при такава скорост, че да се получи отделяне на фазите.

Забележка: Възможно е след центрофугирането течната фаза да е все още мътна. Избистряне може да се получи чрез прибавяне на 1 до 2 g натриев хлорид към течната фаза и повторно центрофугиране.

6.3.4. Инжектират се 3 ml от този разтвор (6.3.3) според условията, описани в раздел 6.1. Тази операция се повтаря. При описаните условия времената на задържане имат следните характерни стойности:

метанол - приблизително 1 min;

ацетонитрил - приблизително 2,5 min;

хлороформ - приблизително 6 min;

диметилформамид - повече от 15 min.

6.3.5. Определяне на относителния отговор на сигнала

Инжектират се 3 ml от разтвор 4.7 двукратно. Относителният отговор на сигнала се определя ежедневно.

7. Изчисления

7.1. Изчисление на относителния отговор на сигнала.

7.1.1. Измерва се височината и широчината на половината височина на пиковете на ацетонитрила и хлороформа и се изчислява площта на двата пика, използвайки формулата: височината x широчината на половината височина на пика.

7.1.2. Определя се площта на пиковете на ацетонитрила и хлороформа в хроматограмите, получени в съответствие с 6.3.5, и се изчислява относителният отговор на сигнала fs по следната формула:

	As x Mi			As x M
fs=	_______________________________________	x 100	% =	__________________,
	fs x Ms x Ai			fs x Ai x Mо x 100

където:

fs - относителният отговор на сигнала за хлороформа

As - площта на хлороформения пик (6.3.5);

Ai - площта на ацетонитриловия пик (6.3.5);

Ms - количеството хлороформ за 10 cm3 (ml) от разтвор 4.7 (=M1) в mg;

Mi - количеството ацетонитрил за 10 cm3 (ml) от разтвор 4.7 (1/10 M) в mg

Изчисляват се средните стойности на получените резултати.

7.2. Изчисляване съдържанието на хлороформ.

7.2.1. Площта на пиковете на хлороформа и ацетонитрила от получените хроматограми (6.3.4) се изчислява в съответствие със 7.1.1.

7.2.2. Съдържанието на хлороформ в % (X) в пастата за зъби се изчислява по формулата:

	As x Mi			As x M
X %=	_______________________________________	x 100	%=	_________________,
	fs x Ms x Ai			fs x Ai x Mо x 100

където:

Х е съдържанието на хлороформ в пастата за зъби, в %;

Аs - площта на хлороформния пик (6.3.4);

Аi - площта на ацетонитрилния пик (6.3.4);

Мs - масата на пробата 6.3.1 (= 1000 Мо) в mg;

Mi - количеството ацетонитрил за 10 cm3 (ml) от разтвора, получен в съответствие с 6.3.2 (1/10 М) в mg.

Средната стойност на получените резултати се изчислява с точност 0,1 %.

8. Повторяемост (виж ISO 5725)

За съдържание на хлороформ до 3 % разликата между резултатите на две успоредни определения на една и съща проба не трябва да превишава абсолютната стойност 0,3 %.

VI. Определяне на цинк

1. Област на приложение

Този метод е подходящ за определяне съдържанието на цинк като хлорид, сулфат или 4-хидроксибензолсулфонат, или като комбинация от някои от тези цинкови соли в козметични продукти.

2. Дефиниция

Съдържанието на цинк в пробата се определя гравиметрично като бис (2-метил-8-хинолил оксид) и се изчислява като цинк в % (М/М).

3. Принцип

Съдържащият се в разтвор цинк се утаява в кисела среда като цинк бис (2-метил-8-хинолил оксид). След филтруване утайката се изсушава и претегля.

4. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а), а водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.

4.1. Концентриран амоняк - 25 % (М/М)

4.2. Ледена оцетна киселина

4.3. Амониев ацетат

4.4. 2-метилхинолин-8-ол

4.5. Разтвор на амоняк - 6 % (М/V)

Претеглят се 240 g концентриран амоняк (4.1) в 1000 cm3 (ml) мерителна колба, долива се с дестилирана вода до марката и се разбърква.

4.6. Разтвор на амониев ацетат - 0,2 М

Разтварят се 15,4 g амониев ацетат (4.3) с дестилирана вода в 1000 cm3 (ml) мерителна колба, долива се до марката и се разбърква.

4.7. Разтвор на 2-метилхинолин-8-ол

Разтварят се 5 g 2-метилхинолин-8-ол в 12 cm3 (ml) ледена оцетна киселина и се прехвърлят с дестилирана вода в 100 cm3 (ml) мерителна колба. Долива се с дестилирана вода до марката и се разбърква.

5. Апаратура

5.1. Мерителни колби - 100 и 1000 cm3 (ml)

5.2. Бехерова чаша - 400 cm3 (ml)

5.3. Мерителни цилиндри - 50 и 150 cm3 (ml)

5.4. Градуирани пипети - 10 cm3 (ml)

5.5. Стъклен филтър G-4

5.6. Смукателни шишета - 500 cm3 (ml)

5.7. Водоструйна помпа

5.8. Термометър градуиран - от 0 до 100 градуса С

5.9. Ексикатор с подходящ сушител и индикатор за влажност, напр. силикагел или еквивалентен такъв

5.10. Сушилен шкаф с регулиране на температурата до 150 +/- 2 градуса С

5.11. рН метър

5.12. Нагревателна плоча

5.13. Филтърна хартия Whatman № 4 или еквивалентна

6. Процедура

6.1. В бехерова чаша 400 cm3 (ml) се претеглят 5 до 10 g с точност 0,001 g от пробата (М g), която трябва да се анализира, съдържащи около 50 до 100 mg цинк, прибавят се 50 cm3 (ml) дестилирана вода и се разбърква.

6.1.1. Ако е необходимо, се филтрува на вакуумпомпа и филтратът се запазва.

6.1.2. Екстракцията се повтаря с още 50 cm3 (ml) дестилирана вода. Филтрува се и филтратите се събират.

6.2. За всеки 10 mg цинк, намиращ се в разтвора (6.1.2), се прибавят 2 cm3 (ml) разтвор на 2-метилхинолин-8-ол (4.7) и се разбърква.

6.3. Сместа се разрежда със 150 cm3 (ml) дестилирана вода, загрява се до 60 градуса С (5.12) и се прибавят 45 cm3 (ml) 0,2 M разтвор на амониев ацетат (4.6) при непрекъснато разбъркване.

6.4. Нагласява се рН на разтвора до 5,7 - 5,9 с 6 % амонячен разтвор (4.5) при непрекъснато разбъркване, използвайки рН метър.

6.5. Разтворът се оставя да престои 30 min. Филтрува се на водна помпа през стъклен филтър G-4, предварително изсушен (150 градуса С) и претеглен след охлаждане (Мо g). Утайката се промива със 150 cm3 (ml) гореща дестилирана вода (95 градуса С).

6.6. Филтърът с утайката се поставя в сушилен шкаф и се суши при 150 градуса С в продължение на 1 h.

6.7. Филтърът с утайката се изважда от сушилния шкаф, поставя се в ексикатор (5.9) и след охлаждане до стайна температура се претегля (М1 g).

7. Изчисления

Съдържанието на цинк в пробата (С) се изчислява в % (М/М) по формулата:

	(М1 - Мо) x 17,12
C %=	_________________,
	М

където:

М е масата на пробата (6.1) в g;

Мо - масата на празния и изсушен стъклен филтър (6.5) в g;

М1 - масата на стъкления филтър с утайката (6.7) в g.

8. Повторяемост (виж ISO 5725)

За съдържание на цинк до 1 % (М/М), разликата в резултатите между две паралелни определения върху една и съща проба не трябва да надвишава абсолютната стойност 0,1 %.

VII. Определяне и идентификация на 4-хидроксибензолсулфонова киселина

1. Област на приложение

Този метод е подходящ за идентификация и определяне на 4-хидроксибензолсулфонова киселина в козметични продукти като аерозоли и лосиони за лице.

2. Дефиниция

Съдържанието на 4-хидроксибензолсулфонова киселина, определено в съответствие с този метод, се изразява като процент безводен цинк 4-хидроксибензолсулфонат в продукта.

3. Принцип

Пробата се концентрира под намалено налягане, разтваря се във вода и се пречиства чрез екстракция с хлороформ. Определянето на 4-хидроксибензолсулфонова киселина се извършва йодометрично върху аликвотна част от филтрирания воден разтвор.

4. Реактиви

Всички реактиви трябва да бъдат с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а), а водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.

4.1. Концентрирана солна киселина - 36 % (М/М) (d420 = 1,18)

4.2. Хлороформ

4.3. Бутан-1-ол

4.4. Ледена оцетна киселина

4.5. Калиев йодид

4.6. Калиев бромид

4.7. Натриев карбонат

4.8. Сулфанилова киселина

4.9. Натриев нитрит

4.10. Калиев бромат - 0,1 N

4.11. Разтвор на натриев тиосулфат - 0,1 N

4.12. Воден разтвор на скорбяла - 1 % (М/V)

4.13. Воден разтвор на натриев карбонат - 2 % (M/V)

4.14. Воден разтвор на натриев нитрит - 4,5 % (M/V)

4.15. Разтвор на дитизон в хлороформ - 0,05 % (M/V)

4.16. Разтворител за проявяване на хроматограмата (подвижна фаза) - бутан-1-ол : ледена оцетна киселина : вода = 4:1:5. След смесване в делителна фуния долната фаза се изхвърля.

4.17. Реактив на Pauly:

4,5 g сулфанилова киселина (4.8) се разтваря в 45 cm3 (ml) концентрирана солна киселина (4.1) при загряване и се разрежда с вода до 500 cm3 (ml). 10 cm3 (ml) от разтвора се изстудяват в съд с ледена вода и при разбъркване се добавят 10 cm3 (ml) студен разтвор на натриев нитрит (4.14). Разтворът се оставя да престои 15 min при 0 градуса С (при тази температура той остава стабилен за 1 до 3 дни) и непосредствено преди напръскването на хроматограмата (7.5) се добавят 20 cm3 (ml) разтвор на натриев карбонат (4.13).

4.18. Готови целулозни плаки за тънкослойна хроматография (20x20 cm), дебелина на слоя адсорбент 0,25 mm.

5. Апаратура

5.1. Колби с кръгло дъно с шлифована стъклена запушалка - 100 cm3 (ml);

5.2. Делителни фунии - 100 cm3 (ml);

5.3. Конусна колба с шлифована стъклена запушалка - 250 cm3 (ml);

5.4. Бюрета - 250 cm3 (ml);

5.5. Пипети - 1, 2 и 10 cm3 (ml);

5.6. Градуирана пипета - 5 cm3 (ml);

5.7. Микроспринцовка - 10 ml с 0,1 ml деления;

5.8. Термометър - градуиран от 0 до 100 градуса С;

5.9. Водна баня - оборудвана с нагряващ елемент;

5.10. Сушилен шкаф - добре вентилиран и регулиран до 80 градуса С;

5.11. Стандартна апаратура за тънкослойна хроматография.

6. Подготовка на пробата

В метода за идентификация и определяне на хидроксибензолсулфоновата киселина в аерозоли се използва остатък, получен след освобождаването на аерозолната опаковка от разтворителите и пропелантите, които се изпаряват при нормално налягане.

7. Идентификация

7.1. С помощта на микроспринцовка (5.7) се нанасят по 5 ml от остатъка (6) или пробата на всяка от шестте точки върху началната линия (старт) на разстояние 1 cm от долния край на тънкослойната плака (4.18).

7.2. Плаката се поставя в хроматографската вана, съдържаща разтворителя за проявяване (подвижна фаза 4.16), и се хроматографира, докато фронтът на разтворителя достигне 15 cm от началната линия.

7.3. Плаката се изважда от ваната и изсушава при 80 градуса С, докато миризмата на оцетна киселина престане да се усеща. Плаката се напръсква с разтвор на натриев карбонат (4.13) и се изсушава на въздух.

7.4. Покрива се половината от плаката със стъклена плочка и се напръсква непокритата част с 0,05 % разтвор на дитизон (4.15). Появата на червеноморави петна в хроматограмата показва наличие на цинкови йони.

7.5. Покрива се напръсканата половина на плаката със стъклена плочка и се напръсква другата половина с реактива на Поли (4.17). Наличието на 4-хидроксибензолсулфонова киселина се доказва чрез появата на жълтеникаво-кафяво петно със стойност на Rf около 0,26, докато жълтото петно със стойност на Rf около 0,45 в хроматограмата показва наличие на 3-хидроксибензолсулфонова киселина.

8. Определяне

8.1. Претеглят се 10 g с точност 0,001 g от пробата или остатъка (6) в 100 cm3 (ml) колба с кръгло дъно и се изпарява почти до сухо на вакуумротационен изпарител на водна баня, поддържана при 40 градуса С.

8.2. Прибавят се 10 cm3 (ml) (V1) вода в колбата и се разтваря остатъкът от изпаряването (8.1) чрез нагряване.

8.3. Разтворът се пренася количествено в делителна фуния и се екстрахира два пъти с по 20 cm3 (ml) хлороформ (4.2). След всяка екстракция хлороформната фаза се изхвърля.

8.4. Водният разтвор се филтрува през нагънат филтър. В зависимост от очакваното съдържание на хидроксибензолсулфонова киселина се отпипетирват 1,0 или 2,0 cm3 (ml) (V2) от филтрата в 250 cm3 (ml) конусна колба (5.3) и се разреждат с вода до 75 cm3 (ml).

8.5. Добавят се 2,5 cm3 (ml) 36 % солна киселина (4.1) и 2,5 g калиев бромид (4.6), разбърква се и се нагласява температурата на разтвора до 50 градуса С на водна баня.

8.6. Добавя се 0,1 N калиев бромат (4.10) от бюрета, докато разтворът, който е загрят до 50 градуса С, стане жълт.

8.7. Добавят се 3,0 cm3 (ml) разтвор на калиев бромат (4.10), колбата се затваря и се оставя да престои 10 min на водна баня при 50 градуса С. Ако след 10 min разтворът загуби цвета си, добавят се още 2 cm3 (ml) от разтвора на калиев бромат (4.10), колбата се затваря и загрява за 10 min на водна баня при 50 градуса С. Записва се цялото количество на прибавения разтвор от калиев бромат (а).

8.8. Разтворът се изстудява при стайна температура, прибавят се 2 g калиев йодид (4.5) и се разбърква.

8.9. Отделеният йод се титрува с 0,1 N разтвор на натриев тиосулфат (4.11).

В края на титруването се прибавят няколко капки от разтвор на скорбяла (4.12) като индикатор. Записва се количеството на използвания натриев тиосулфат (b).

9. Изчисление

Съдържанието на цинк хидроксибензолсулфонат в пробата или остатъка (b) като % (М/М) се изчислява по формулата:

	(а - b) x V1 x 0,00514 x 100
%М/М цинк хидроксибензолсулфонат =	_______________________________,
	М x V2

където:

а е общото количество на добавения 0,1 N разтвор от калиев бромат (8.7) в cm3 (ml);

b - количеството на добавения 0,1 N разтвор от натриев тиосулфат, използван при обратното титруване (8.9) в cm3 (ml);

M - количеството на анализирания продукт или остатък в g;

V1 - обемът на получения разтвор в съответствие с 8.2 в cm3 (ml);

V2 - обемът на разтворения изпарен остатък, използван за анализа (8.4), в cm3 (ml).

Забележка: В случай на аерозоли резултатът от определянето в % (M/M) на остатъка (b) трябва да се изрази спрямо оригиналния продукт. За целта на това превръщане трябва да се направи справка за правилата при пробовземане на аерозоли.

10. Повторяемост (виж ISO 5725)

За съдържание на цинк хидроксибензолсулфонат до около 5 % (M/M), разликата между резултатите на две успоредни определения върху една и съща проба не трябва да превишава абсолютната стойност 0,5 %.

11. Интерпретация на резултатите

Съгласно Наредба № 26 от 2001 г. за изискванията към козметичните продукти (ДВ, бр. 60 от 2001 г.) максимално допустимата концентрация на цинк 4-хидроксибензолсулфонат в лосиони за лице и дезодоранти е 6 % (M/M). Това означава, че освен съдържанието на хидроксибензолсулфонова киселина трябва да се определи и съдържанието на цинк.

Умножението на изчисленото съдържание на цинк хидроксибензолсулфонат (9) по коефициент 0,1588 дава минималното цинково съдържание в % (M/M), което трябва да се съдържа в продукта от гледна точка на измереното съдържание на хидроксибензолсулфонова киселина. Действителното цинково съдържание, измерено гравиметрично (виж съответните условия), може обаче да бъде по-високо, защото цинковият хлорид и цинковият сулфат могат също да бъдат използвани в козметичните продукти.

VIII. Идентификация на окислителни агенти и определяне на водороден прекис в продукти за поддържане на косата

Област на приложение

Йодометричното определяне на водороден прекис в козметиката е възможно само в отсъствие на други окислителни агенти, които образуват йод от йодиди. Ето защо преди йодометричното определение на водороден прекис е необходимо да се открият и идентифицират всички други налични окислителни агенти. Това определение се състои от два етапа; първият обхваща определяне на персулфати, бромати и водороден прекис, а вторият - на бариев прекис.

А. Идентификация на персулфати, бромати и водороден прекис

1. Принцип

Натриев персулфат, калиев персулфат и амониев персулфат; калиев бромат, натриев бромат и водороден прекис - независимо дали произлизат или не от бариев прекис, се определят чрез низходяща хартиена хроматография, като се използват два проявяващи разтворителя (подвижни фази).

2. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.

2.1. 0,5 % (М/V) водни стандартни разтвори на следните компоненти:

2.1.1. Натриев персулфат

2.1.2. Калиев персулфат

2.1.3. Амониев персулфат

2.1.4. Калиев бромат

2.1.5. Натриев бромат

2.1.6. Водороден прекис

2.2. Проявяващ разтворител А (подвижна фаза А) - 80 % (V/V) етанол

2.3. Проявяващ разтворител Б (подвижна фаза Б) - бензол : метанол : метилбутан-1-ол : вода = 34 : 38 : 18 : 10 (V/V/V/V)

2.4. Детектор А (реактив за оцветяване А), 10 % (M/V) воден разтвор на калиев йодид

2.5. Детектор Б (реактив за оцветяване Б), 1 % (M/V) воден разтвор на скорбяла

2.6. Детектор В (реактив за оцветяване В), 10 % (M/М) солна киселина

2.7. Солна киселина, 4 N

3. Апаратура

3.1. Хроматографска хартия (Whatman хартия № 3 и № 4 или еквивалентна)

3.2. Микропипета - 1 ml

3.3. Мерителни колби - 100 cm3 (ml)

3.4. Нагънати филтри

3.5. Апаратура за низходяща хартиена хроматография

4. Процедура

4.1. Водоразтворими продукти

От всяка проба се приготвят по два разтвора чрез разтваряне на 1 g и 5 g от продукта в 100 cm3 (ml) вода. От всеки от тези разтвори се използва по 1 ml за извършване на хроматографски анализ чрез хартиена хроматография, както е описано в т. 5.

4.2. Продукти, частично разтворими във вода

4.2.1. От всяка проба се претеглят по 1 g и 5 g и се диспергират в 50 cm3 (ml) вода. Доливат се до 100 cm3 (ml) и се разбърква. Двете дисперсии се филтруват през филтър (3.4). От всеки филтрат се използва по 1 ml за извършване на хроматографски анализ чрез хартиена хроматография, както е описано в т. 5.

4.2.2. От всяка проба се приготвят още веднъж две дисперсии - 1 g и 5 g проба се диспергират в 50 cm3 (ml) вода, подкислява се с разредена солна киселина (2.7), долива се с вода до 100 cm3 (ml) и се хомогенизира. Филтрува се през нагънат филтър (3.4). От двата филтрата се използва по 1 ml за извършване на хроматографски анализ чрез хартиена хроматография, както е описано в т. 5.

4.3. Кремове

5 g и 20 g от всеки продукт се диспергират в 100 cm3 (ml) вода. Получените дисперсии се използват за извършване на хроматографски анализ чрез хартиена хроматография, както е описано в т. 5.

5. Процедура

5.1. В две хроматографски вани се поставя достатъчно количество подвижни фази А (2.2) и Б (2.3) за извършване на хроматографски анализ чрез хартиена хроматография. Хроматографските вани се насищат най-малко 24 h с парите на подвижната фаза и плътно се затварят с подходящ капак.

5.2. Върху стартови точки от лентата на хроматографската хартия (Whatman № 3 или еквивалентна) с дължина 40 cm и широчина 20 cm (3.1) се нанасят по 1 ml от единия разтвор на анализираната проба и от стандартния разтвор, приготвени според т. 4 и т. 2.1. Изсушава се на въздуха.

5.3. Хроматографската лента (5.2) се поставя в хроматографската вана, напълнена с подвижна фаза (5.1). Хроматографира се, докато фронтът на подвижната фаза се придвижи на 35 сm (около 5 h).

5.4. Процедурите по т. 5.2 и т. 5.3 се повтарят, като се използват подвижна фаза Б и хроматографска хартия (Whatman № 4 или еквивалентна) (3.1). Хроматографира се до достигане на фронта (35 cm).

5.5. Хроматограмите се изваждат и се изсушават на въздуха.

5.6. Детектиране (оцветяване): хроматограмата се напръсква последователно със:

5.6.1. детектор А (2.4), последван от детектор Б (2.5); петната на персулфатите в пробата и в съответния стандартен разтвор (2.1) са по-близо до старта от тези на водородния прекис; петната се маркират с молив;

5.6.2. детектор В (2.6) върху хроматограмите, получени съгласно т. 5.6.1; при наличие на бромати върху хроматограмата се появяват сиво-сини петна, идентични с тези на стандартния разтвор (2.1).

5.7. При посочените условия, отнасящи се до подвижни фази А (2.2) и Б (2.3), Rf-стойностите на стандартните вещества (2.1) са приблизително следните:

Подвижна фаза

Подвижна фаза

	А (2.2)	Б (2.3)
Натриев персулфат	0.40	0.10
Калиев персулфат	0.40	0.02 + 0.05
Амониев персулфат	0.50	0.10 + 0.20
Натриев бромат	0.40	0.20
Калиев бромат	0.40	0.10 + 0.20
Водороден прекис	0.80	0.80

Б. Идентификация на бариев прекис

1. Принцип

Бариевият прекис се идентифицира след подкисляване на пробата (А.4.2) чрез образуването на водороден прекис в присъствие на бариевия йон:

- при отсъствието на персулфати (А) (Б.4.1) - чрез добавяне на разредена сярна киселина към една част от киселия разтвор на пробата (Б.4.1), в резултат на което се образува бяла утайка от бариев сулфат. Присъствието на бариев йон в пробата (Б.4.1) се доказва чрез хартиена хроматография по описания по-долу начин (Б.5);

- при наличие на персулфати (Б.4.2) - последователно се извършва следното: изваряване на остатъка от разтвора (Б.4.2) в алкална среда и разтваряне в солна киселина; в разтвора, получен от стопилката (Б.4.2) присъствието на бариеви йони се доказва чрез хартиена хроматография и/или чрез утаяване като бариев сулфат.

2. Реактиви - всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.

2.1. Метанол

2.2. Концентрирана солна киселина - 36 % (M/M)

2.3. Солна киселина - 6 N

2.4. Сярна киселина - 4 N

2.5. Динатриева сол на родизониевата киселина

2.6. Бариев хлорид (BaCl2.2H2O)

2.7. Безводен натриев карбонат

2.8. Воден разтвор на бариев хлорид 1 % (М/V)

2.9. Проявяващ разтворител (подвижна фаза) - метанол : концентрирана солна киселина (концентрация 36 %) : вода = 80 : 10 : 10 (V/V/V).

2.10. Детектор (реактив за оцветяване) - 0,1 % (M/V) воден разтвор на динатриева сол на родизониевата киселина, приготвени непосредствено преди употреба.

3. Апаратура

3.1. Микропипета - 5 ml

3.2. Платинени тигли

3.3. Мерителни колби - 100 cm3 (ml)

3.4. Хроматографска хартия Schleicher и Schull 2043b или еквивалентна. Хартията се обработва предварително, като се поставя за една нощ в съд за нисходяща хроматография (А.3), съдържащ проявяващ разтворител (подвижна фаза) (Б.2.9.), след което се изсушава.

3.5. Нагънат филтър

3.6. Апаратура за осъществяване на възходяща хартиена хроматография

4. Подготовка на пробата

4.1. Проби, в които няма персулфати:

4.1.1. два грама от продукта се диспергират в 50 cm3 (ml) вода и се довежда до pH на дисперсията приблизително 1 със солна киселина (Б.2.3);

4.1.2. дисперсията се прехвърля с вода в мерителна колба от 100 cm3 (ml), долива се с вода до марката и се разбърква; приготвената дисперсия се използва за анализ чрез хартиена хроматография, както е описано в т. 5, за идентифициране на барий чрез утаяване на сулфата.

4.2. Проби, в които има персулфати:

4.2.1. два грама от продукта се диспергират в 100 cm3 (ml) вода и се филтрува;

4.2.2. към изсушения остатък се прибавя натриев карбонат (Б.2.7) в количество 7 до 10 пъти от неговото тегло, разбърква се и сместа се стапя в платинов тигел (Б.3.2) за 30 min;

4.2.3. охлажда се до стайна температура и стопилката се разтваря в 50 cm3 (ml) вода и се филтрува (Б.3.5);

4.2.4. остатъкът върху филтъра се разтваря в солна киселина (Б.2.3) и се долива с вода до 100 cm3 (ml). Този разтвор се използва за анализ чрез хартиена хроматография, както е описано в т. 5, и за определяне на барий чрез утаяване на сулфата.

5. Процедура

5.1. Подходящо количество от проявяващия разтворител (подвижната фаза) (Б.2.9) сe поставя във ваната за възходяща хартиена хроматография. Последната се насища с парите на разтворителя минимум 15 h.

5.2. Върху три стартови точки на лист от хроматографската хартия, предварително обработена, както е описано в т. Б.3.4, се накапва по 5 ml от приготвените разтвори съгласно т. Б.4.1.2. и т. Б.4.2.4 и от стандартния разтвор (Б.2.8).

5.3. Петната се изсушават на въздуха. Хроматографира се до достигане на фронта (30 cm).

5.4. Хроматограмата се изважда от ваната и се изсушава на въздуха.

5.5. Детектиране (оцветяване) - хроматограмата се напръсква с детектор (Б.2.10). При наличие на барий върху хроматограмата се появяват червени петна с Rf-стойност около 0,10.

В. Определяне на водороден прекис в козметични продукти за поддържане на косата

1. Област на приложение

Йодометричното определяне на водороден прекис в козметични продукти е възможно само при отсъствие на други окислителни агенти, които отделят йод от йодидите.

2. Принцип

Йодометричното определяне на водороден прекис се основава на следната реакция:

Н2О2 + 2Н+ + 2I - (r) I2 + 2Н2О

Реакцията протича много бавно, но може да се ускори чрез прибавяне на алуминиев молибдат. Отделеният йод се определя титриметрично с натриев тиосулфат и е еквивалентен на съдържанието на водороден прекис.

3. Дефиниция

Съдържанието на водороден прекис, определено по начина, описан по-долу, се изразява като % (М/М) на продукта.

4. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.

4.1. Сярна киселина - 1 mol/dm3 (2 N)

4.2. Калиев йодид

4.3. Амониев молибдат

4.4. Натриев тиосулфат - 0,1 mol/dm3 (0,1 N)

4.5. Kалиев йодид - 10 % (M/V), приготвен непосредствено преди използването

4.6. Амониев молибдат - 20 % (M/V)

4.7. Скорбелен разтвор - 1,0 % (M/V)

5. Апаратура

5.1. Бехерови чаши - 100 cm3 (ml).

5.2. Бюрета - 50 cm3 (ml)

5.3. Мерителни колби - 250 cm3 (ml)

5.4. Мерителни цилиндри - 25 и 100 cm3 (ml)

5.5. Пипети - 10 cm3 (ml)

5.6. Ерленмайерови колби - 250 cm3 (ml)

6. Процедура

6.1. В бехерова чаша 100 cm3 (ml) се претеглят 10 g (М) с точност 0,001 g от продукта, съдържащ около 0,6 g водороден прекис. Пробата се прехвърля с вода в 250 cm3 (ml) мерителна колба, долива се до марката с вода и се разбърква.

6.2. Отпипетирват се 10 cm3 (ml) от разтвора на пробата и се прехвърлят в 250 cm3 (ml) ерленмайерова колба (5.6). Прибавят се последователно 100 cm3 (ml) разтвор на сярна киселина (4.1), 20 cm3 (ml) разтвор на калиев йодид (4.5) и три капки разтвор на амониев молибдат (4.6).

6.3. Отделеният йод се титрува веднага с разтвор на натриев тиосулфат (4.4) и малко преди достигане на еквивалентния пункт се прибавят няколко cm3 (ml) скорбелен разтвор като индикатор (4.7). Отчита се изразходваното количество (V) разтвор на натриев тиосулфат (4.4) в cm3 (ml).

6.4. По начина, описан в т. 6.2 и 6.3, се титрува празна проба, като се заместват 10 cm3 (ml) от разтвора на пробата с 10 cm3 (ml) вода. Отчита се изразходваното количество разтвор (Vо) на натриев тиосулфат за празната проба в cm3 (ml).

7. Изчисление

Съдържанието на водороден прекис в продукта като % (М/М) се изчислява по формулата:

	(V - Vо) x 1,7008 x 250 x 100		(V - Vо) x 4,252
% водороден прекис =	________________________________________________________________________________________________	=	__________________,
	М x 10 x 1000		М

където:

М е количеството от анализирания продукт (6.1) в g;

Vо - изразходваното количество разтвор на натриев тиосулфат за титруването на празната проба (6.4) в cm3 (ml);

V - изразходваното количество разтвор на натриев тиосулфат за титруването на пробата (6.3) в cm3 (ml).

8. Повторяемост (виж ISO 5725)

За продукти, съдържащи около 6 % (М/М) водороден прекис, разликата между резултатите от две определения, проведени паралелно върху една и съща проба, не трябва да превишава абсолютната стойност 0,2 %.

IХ. Идентификация и полуколичествено определяне на някои окислителни багрила в бои за коса

1. Област на приложение

Методиката се отнася за идентификация и полуколичествено определяне на следните субстанции в бои за коса в течна и кремообразна форма:

Субстанция	Означение
Фенилендиамини
o-фенилендиамин	(о-ФДА)
m-фенилендиамин	(м-ФДА)
р-фенилендиамин	(п-ФДА)
Метилфенилендиамини
4-метил-1,2-фенилендиамин (толуен-3,4-диамин)	(о-ТДА)
4-метил-1,3-фенилендиамин (толуен-2,4-диамин)	(м-ТДА)
2-метил-1,4-фенилендиамин (толуен-2,5-диамин)	(п-ТДА)
Диаминофеноли	(ДАФ)
2,4-диаминофенол
Хидрохинон	(Х)
1,4-бензендиол	(а-Н)
a-нафтол
Пирогалол	(П)
1,2,3-трихидроксибензен
Резорцинол	(Р)
1,3-дихидроксибензен

2. Принцип

Окислителните багрила, съдържащи се в бои за коса в течна и кремообразна форма, се екстрахират с 96 % етанол при рН 10 и се идентифицират с едно- и двупосочна тънкослойна хроматография.

За полуколичествено определяне на тези субстанции хроматограмата на пробите се сравнява с тази на стандартни субстанции в 4 проявяващи системи (подвижни фази), получени едновременно и при същите условия.

3. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.

3.1. Етанол - безводен.

3.2. Ацетон.

3.3. Етанол - 96 % (V/V).

3.4. Амонячен разтвор - 25 % (d420 = 0,91).

3.5. L(+)-аскорбинова киселина.

3.6. Хлороформ.

3.7. Циклохексан.

3.8. Азот - технически.

3.9. Толуен.

3.10. Бензен.

3.11. н-Бутанол.

3.12. Бутан-2-ол.

3.13. Хипофосфорна киселина - 50 % (V/V).

3.14. Диазо реагент:

• 3-нитро-1-бензендиазониев хлоробензенсулфонат (стабилизирана сол),

• 2-хлоро-4-нитро-1-бензендиазониев нафталенбензоат (стабилизирана сол)

3.15. Сребърен нитрат.

3.16. п-Диметиламинобензалдехид.

3.17. 2,5-Диметилфенол.

3.18. Ферихлорид хексахидрат.

3.19. Солна киселина - 10 % (V/V).

3.20. Стандартни субстанции.

Стандартнитe субстанции са посочени в т. 1.

При аминосъединенията стандартната субстанция трябва да бъде или хидрохлорид (моно- или ди-), или свободна основа.

3.21. Стандартни разтвори - 0,5 % (M/V)

Приготвя се 0,5 % (M/V) разтвор на всяка стандартна субстанция (3.20).

Претеглят се 50 mg +/- 1 mg от стандартната субстанция в мерителна колба 10 cm3 (ml).

Добавят се 5 cm3 (ml) 96 % етанол (3.3) и 250 mg аскорбинова киселина (3.5).

Разтворът се алкализира с амонячен разтвор (3.4) до рН 10 (тест с индикаторна хартия).

Долива се до 10 cm3 (ml) с 96 % етанол (3.3) и се разбърква.

Разтворите могат да се съхраняват до една седмица на студено и тъмно място.

В някои случаи след добавянето на аскорбинова киселина и амоняк може да се образува утайка.

Преди работа тези разтвори се оставят да се утаят.

3.22. Системи разтворители за хроматографско разделяне (подвижни фази)

3.22.1. Ацетон : хлороформ : толуен = 35 : 25 : 40 (V/V/V).

3.22.2. Хлороформ : циклохексан : абсолютен етилов алкохол : 25 % амоняк = 80 : 10 : 10 : 1 (V/V/V/V).

3.22.3. Бензен : бутан-2-ол : вода = 50 : 25 : 25 (V/V/V).

Разклаща се добре след разделяне при стайна температура (20 градуса C до 25 градуса С) и се използва горната фаза.

3.22.4. н-Бутанол : хлороформ : реагент М = 7 :70 : 23 (V/V/V).

Разделя се внимателно при стайна температура (20 градуса С до 25 градуса С) и се използва долната фаза.

Реагент М:

Амонячен разтвор, 25 % (V/V) - 24 обемни части

Хипофосфорна киселина, 50 % (3.13) - 1 обемна част

Вода - 75 обемни части

Забележка: Подвижните фази, съдържащи амоняк, трябва да се разклащат непосредствено преди употреба.

3.23. Индикаторни спрейове (проявяващи реактиви).

3.23.1. Diaso реагент.

От избрания реагент (3.14) се приготвя непосредствено преди употреба 5 % (M/V) воден разтвор.

3.23.2. Реагент на Eрлих.

Разтварят се 2,0 g п-диметиламинобензалдехид (3.16) в 100 cm 3 (ml) воден разтвор на солна киселина 10 % (M/V) (3.19).

3.23.3. 2,5-Диметилфенол-ферихлорид хексахидрат.

Разтвор 1: Разтваря се 1,0 g диметилфенол (3.17) в 100 cm3 (ml) 96 % етанол (3.3).

Разтвор 2: Разтварят се 4,0 g ферихлорид хексахидрат (3.18) в 100 cm3 (ml) 96 % етанол (3.3).

За проявяване хроматограмата се пръска последователно с разтвор 1 и после с разтвор 2.

3.23.4. Сребърен нитрат - амонячен разтвор

Към 5 % (M/V) воден разтвор на сребърен нитрат (3.15) се добавя 25 % амоняк (3.4), докато утайката се разтвори. Приготвя се непосредствено преди употреба. Остатъкът от разтвора се изхвърля.

4. Апаратура

4.1. Стандартна апаратура за тънкослойна хроматография.

4.1.1. Пластмасов или стъклен капак с конструкция, която осигурява хроматографската плака да бъде в азотна атмосфера при проявяване и сушене на петната. Тази предпазна мярка е необходима поради податливостта на някои багрила към окисление.

4.1.2. Микроспринцовка от 10 ml, градуирана през 0,2 ml, с игла с квадратно сечение или препоръчително дозаторно устройство от 50 ml, монтирано върху скобата на статива, така че плаката да бъде под азот.

4.1.3. Тънкослойни силикагелни плаки 20 x 20 сm с дебелина на слоя 0,25 mm (Macherey and Nagel, Silica G-HR или еквивалентни).

4.2. Центрофуга - 4000 rpm.

4.3. Центрофужни епруветки - 10 cm3 (ml), с полиетиленови капачки на винт или еквивалентни.

5. Процедура

5.1. Подготовка на пробите

При изстискване на тубата първите 2-3 cm се отстраняват. В центрофужна епруветка (4.3), предварително продухана с азот, се поставят 300 mg аскорбинова киселина и 3,0 g кремообразна или хомогенизирана течна боя. Добавя се 25 % амоняк (3.4) на капки до рН 10. Долива се до 10 cm3 (ml) с 96 % етанол (3.3) и се хомогенизира под азот (3.8), ценрофугира се 10 min при 4000 rpm. Изследва се горният слой на течната фаза.

5.2. Хроматографски анализ

5.2.1. Нанасяне на разтворите върху плаките

На хроматографската плака (4.1.3) се маркира стартова линия на 1,5 cm от ръба й. Върху 9 точки се нанасят по 1,0 ml от стандартните разтвори в посочения ред:

1	2	3	4	5	6	7	8	9
Р	П	Х	п-ФДА	ДАФ	п-ТДА	о-ФДА	о-ТДА	м-ФДА
м-ТДА	a-H

Върху точки 10 и 11 се нанасят по 2,0 ml от разтвора на пробата (5.1).

Нанасянето на стандартите и пробите се извършва под азот (3.8) и плаката се държи под азот до момента на хроматографирането.

5.2.2. Хроматографско разделяне

Хроматографската вана е предварително продухана с азот (3.8) и наситена с една от четирите подвижни фази (3.22). Плаката се поставя във ваната при стайна температура (20 градуса С до 25 градуса С) на тъмно, докато фронтът достигне 15 сm от стартовата линия, след което се изважда и изсушава под азот (3.8) при стайна температура.

5.2.3. Проявяване на петната

Плаката се напръсква веднага с един от четирите разтвора, описани в 3.23.

5.2.4. Идентифициране

Сравняват се Rf-стойностите и цветовете на получените петна от пробата с тези на стандартните разтвори.

В таблица 1 са представени Rf-стойностите и цветовете на петната на всички стандартни субстанции в съответните подвижни фази и използваните проявяващи реактиви.

По тази методика понякога може да се получи спорна идентификация при сравняване на петната на съответните стандартни субстанции с тези на пробата.

5.2.5. Полуколичествено определяне

Сравнява се визуално интензивността на петната на всяко вещество, идентифицирано съгласно т. 5.2.4, със серия от стандартни разтвори с подходяща концентрация.

Ако концентрацията на една или повече субстанции в пробата е много висока, пробата се разрежда и определението се повтаря.

Таблица 1

Rf-стойности и цветове на петната, получени веднага след напръскването

Стандартна
субстанция
(3.20)	Подвижна фаза	Индикаторни спрейове (проявяващи реактиви)
	Rf-стойности	Цветове на получените петна

	(3.22.1)	(3.22.2)	(3.22.3)	(3.22.4)	Diaso	Eрмих	Диметил	Сребърен нитрат
					(3.23.1)	(3.23.2)	фенол	(3.23.4)
							(3.23.3)
о-ФДА	0,62	0,60	0,30	0,57	Бледо-кафяв	-	-	Бледокафяв
м-ФДА	0,40	0,60	0,47	0,80	Виолетово-кафяв(*)	Жълт	Бледокафяв	Бледокафяв
п-ФДА	0,20	0,50	0,30	0,48	Кафяв	Светлочервен(*)	Виолетов	Сив
о-ТДА	0,60	0,60	0,53	0,60	Кафяв(*)	Бледооранжев	Бледокафяв	Сиво-кафяв
м-ТДА	0,40	0,67	0,45	0,60	Червено-кафяв(*)	Жълт	Кафяв	Черен
п-ТДА	0,33	0,65	0,37	0,70	Кафяв	Оранжев	Виолетов(*)	Сив
ДАФ	0,07	-	0	0,05	Кафяв(*)	Оранжев	Виолетов	Кафяв
Х	0,50	0,35	0,80	0,20	-	Оранжев	Виолетов	Черен(*)
a-H	0,90	0,80	0,90	0,75	Оранжево-кафяв	-	Виолетов(*)	Черен
П	0,37	-	0,67	0,05	Кафяв	Много бледо-	Много бледо-	Кафяв(*)
						виолетов	кафяв
Р	0,50	0,37	0,80	0,17	Оранжев	Бледовиолетов	Много бледо-	Бледокафяв
							кафяв

Ако концентрацията на една или повече субстанции в пробата е много висока, пробата се разрежда и определението се повтаря.

Забележки:

1. о-ФДА се проявява слабо; трябва да се използва подвижна фаза (3.22.3), за да се разграничи ясно от о-ТДА.

2. (*) показва най-добро развитие на цвета.

6. Изпитване с двупосочна тънкослойна хроматография

Двупосочната хроматографска процедура изисква употребата на допълнителни стандарти и реактиви.

6.1. Допълнителни стандартни разтвори и субстанции

6.1.1. b-Нафтол (b-Н).

6.1.2. 2-Аминофенол (о-АФ).

6.1.3. 3-Аминофенол (м-АФ).

6.1.4. 4-Аминофенол (п-АФ).

6.1.5. 2-Нитро-1,4-фенилендиамин (2-НПФДА).

6.1.6. 4-Нитро-1,2-фенилендиамин (4-НОФДА).

Приготвят се 0,5 % (M/V) разтвори на всички допълнителни стандартни субстанции, както е описано в 3.21.

6.2. Допълнителна подвижна фаза

6.2.1. Етилацетат : циклохексан : амонячен разтвор (25 %) = 65 : 30 : 0,5 (V/V/V).

6.3. Допълнителна индикаторна система за проявяване на петната

Във ваната за тънкослойна хроматография се поставя стъклен съд с 2,0 g йодни кристали и ваната се затваря с подходящ капак.

6.4. Хроматографиране

6.4.1. Върху абсорбиращата повърхност на плаката за тънкослойна хроматография (4.1.3) се начертават две линии, както е показано на фиг.1.

6.4.2. Под азотна атмосфера (4.1.1) се нанасят от 1 до 4 ml от екстракта на пробата на стартова точка 1 на фигурата, която е на 2 сm от двете страни на плаката.

Количеството на нанесения екстракт зависи от интензивността на петната върху хроматограмите 5.2.

6.4.3. Нанасят се на стартови точки 2 и 3 (фиг.1) окислителните багрила, които са идентифицирани или предстои да се идентифицират чрез 5.2 (разстоянието между точките е 1,5 cm). От всички стандартни разтвори се нанасят по 2,0 ml, с изключение на ДАФ - от него трябва да се нанесат 6,0 ml. Нанасянето се провежда под азот (6.4.2).

6.4.4. Повтаря се операция (6.4.3) за стартови точки 4 и 5 (фиг.1) - разстояние между точките 1,5 cm, и се оставя плаката под азот до момента на хроматографиране.

6.4.5. Хроматографската вана се продухва с азот (3.8) и се насища с подвижна фаза (3.22.2).

Плаката (6.4.4) се поставя във ваната в първата посока (фиг.1) на тъмно.

Хроматографирането продължава, докато фронтът на подвижната фаза достигне маркираната линия върху плаката (приблизително 13 cm).

6.4.6. Плаката се изважда от ваната и се поставя в друга, предварително продухана с азот, където престоява поне за 60 min, за да се изпарят разтворителите.

6.4.7. В следваща хроматографска вана, също предварително продухана с азот (3.8) и наситена с подвижна фаза (6.2), плаката се поставя обърната на 90градуса .

Хроматографира се във втората посока (също на тъмно), докато фронтът на подвижната фаза достигне начертаната линия върху абсорбиращата повърхност (фиг.1), след което се изважда от ваната и се оставя на въздух да се изпарят разтворителите.

6.4.8. Плаката се поставя за 10 min в хроматографската вана с йодни пари (6.3). Двупосочната хроматограма се тълкува, като се използват Rf-стойностите и цвета на стандартните субстанции, хроматографирани по същото време. В таблица 2 са посочени цветовете на петната на стандартните субстанции.

Забележка: За да се получи максимално оцветяване на петната, хроматограмата се оставя на въздух за половин час след проявяване на петната.

6.4.9. Наличието на окислителни багрила, открити в 6.4.8, може окончателно да се потвърди с повторение на операциите, описани в 6.4.1 до 6.4.8, и добавяне в стартова точка 1, върху количеството нанесена проба (6.4.2), на 1 ml от стандартните разтвори, идентифицирани в т.6.4.8.

Ако не се открие друго петно, сравнено с получената хроматограма в 6.4.8, тълкуването й е правилно.

Таблица 2

Цвят на петната на стандартните субстанции след

хроматографиране и проявяване с йодни пари.

	Цвят след проявяване с йодни пари
Р	Бежов
П	Кафяв
a-Н	Виолетов
b-Н	Бледокафяв
Х	Виолетово-кафяв
м-ФДА	Жълто-кафяв
п-ФДА	Виолетово-кафяв
м-ТДА	Тъмнокафяв
п-ТДА	Жълто-кафяв
ДАФ	Тъмнокафяв
о-АФ	Оранжев
м-АФ	Жълто-кафяв
п-АФ	Виолетово-кафяв
2-НПФДА	Кафяв
4-НОФДА	Оранжев

Фиг. 1

Х. Идентификация и определяне на нитрити

А. Идентификация

1. Област на приложение

Методът се отнася за определяне на нитрити в козметични продукти, в частност в кремове и пасти.

2. Принцип

Присъствието на нитрити се установява чрез образуване на цветни производни с 2-аминобензалдехид фенилхидразон (Nitrin(r)).

3. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.

3.1. Разредена сярна киселина - 2 cm3 (ml) концентрирана сярна киселина (d420 = 1,84) се разреждат с 11 cm3 (ml) дестилирана вода.

3.2. Разредена солна киселина - 2 cm3 (ml) концентрирана солна киселина (d420 = 1,19) се разреждат с 11 cm3 (ml) дестилирана вода.

3.3. Метанол.

3.4. Разтвор на 2-аминобензалдехид фенилхидразон (реактив Nitrin(r)) в метанол.

Претеглят се 2,0 g Nitrin(r) с точност 0,001 g и се прехвърлят количествено в мерителна колба 100 cm3 (ml). На капки се прибавят 4,3 cm3 (ml) разредена солна киселина (3.2) и се разклаща. Долива се до марката с метанол и се разбърква, докато разтворът стане напълно бистър. Разтворът се съхранява в тъмна стъклена бутилка (4.3).

4. Апаратура

4.1. Стъклени чаши - 50 cm3 (ml).

4.2. Мерителна колба - 100 cm3 (ml).

4.3. Тъмна стъклена бутилка - 125 cm3 (ml).

4.4. Стъклена плочка - 10 x 10 cm.

4.5. Пластмасова шпатула.

4.6. Филтърна хартия - 10 x 10 cm.

5. Процедура

5.1. Част от пробата за изследване се разстила равномерно върху стъклената плочка (4.4), така че да покрие повърхността с дебелина на слоя не повече от 1 cm.

5.2. Филтърна хартия (4.6) се напоява с дестилирана вода. Разстила се върху пробата и се притиска с пластмасова шпатула (4.5).

5.3. Изчаква се една min и в центъра на филтърната хартия се накапват:

- две капки разредена сярна киселина (3.1);

- две капки реактив на Nitrin(r) (3.4).

5.4. След 5 до 10 sec филтърната хартия се отстранява и се разглежда на дневна светлина. Присъствието на нитрити се установява от червеникаво-пурпурно оцветяване.

Ако съдържанието на нитрити е ниско, след 5 до 15 sec червеникаво-пурпурното оцветяване се променя в жълто. Тази промяна се наблюдава едва след 1 до 2 min, когато количеството на нитрити е голямо.

Интензивността на червеникаво-пурпурното оцветяване и времето, което протича до промяната му в жълто, може да даде указание за съдържанието на нитрити в пробата.

Б. Определяне

1. Област на приложение

Методът се отнася за определяне на нитрити в козметични продукти.

2. Дефиниция

Съдържанието на нитрити в пробата, определено съгласно този метод, се изразява в % (M/M) натриев нитрит.

3. Принцип

След разреждане с вода и избистряне присъстващите нитрити реагират със сулфаниламид и N-1-нафтилетилендиамин и се измерва оптическата плътност на полученото цветно съединение при дължина на вълната 538 nm.

4. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.

4.1. Избистрящи реактиви - съхраняват се в хладилник и са устойчиви в продължение на една седмица.

4.1.1. Реактив Carrez I:

Разтварят се 106 g калиев цианоферат(II),

/(K4Fe(CN)6.3H2O)/ в дестилирана вода до 1000 сm3 (ml).

4.1.2. Реактив Carrez II:

В мерителна колба 1000 сm3 (ml) се разтварят 219,5 g цинков ацетат /(Zn(CH3COO)2.2H2O)/ и 30 cm3 (ml) ледена оцетна киселина и се долива до марката с дестилирана вода.

10 сm3 (ml) от този разтвор се разрежда до 500 сm3 (ml) с дестилирана вода; 1,0 сm3 (ml) от последния разтвор = 10 mg NaNO2

4.2. Разтвор на натриев нитрит:

В мерителна колба 1000 сm3 (ml) се разтварят 0,500 g натриев нитрит в дестилирана вода и се долива до марката с дестилирана вода. 10 cm3 (ml) от този разтвор се разреждат до 500 cm3 (ml) с дестилирана вода; 1 cm3 (ml) от последния разтвор съдържа 10 mg NaNO2.

4.3. Натриев хидроксид, 1 N

4.4. Сулфаниламид хидрохлорид, 0,2 % (M/V)

В 1000 сm3 (ml) колба се разтварят 2,0 g сулфаниламид в 800 cm3 (ml) вода при нагряване. Охлажда се и се добавят 100 cm3 (ml) концентрирана солна киселина при бъркане. Долива се до марката с дестилирана вода.

4.5. Солна киселина - 5 N

4.6. Реактив N-1-нафтил, приготвен непосредствено преди употреба.

В 100 cm3 (ml) мерителна колба се разтварят 0,1 g N-1-нафтилетилендиамин дихидрохлорид в дестилирана вода и се долива до марката.

5. Апаратура

5.1. Аналитична везна.

5.2. Мерителни колби от 100, 250, 500 и 1000 cm3 (ml).

5.3. Градуирани пипети.

5.4. Мерителни цилиндри от 100 cm3 (ml).

5.5. Нагъната филтърна хартия, свободна от нитрити с диаметър 15 cm.

5.6. Водна баня.

5.7. Спектрофотометър с кювети с дебелина на слоя 1 cm.

5.8. рН-метър.

5.9. Микробюрета от 10 cm3 (ml).

5.10. Стъклени чаши от 250 cm3 (ml).

6. Процедура

6.1. Претеглят се около 0,5 g (M) с точност до 0,0001 g от хомогенизираната проба, прехвърля се количествено с топла вода в стъклена чаша от 250 cm3 (ml) (5.10) и обемът се довежда приблизително до 150 cm3 (ml) с топла дестилирана вода. Чашата (5.10) се поставя във водна баня (5.6) при 80 градуса С за половин час и се разклаща периодично.

6.2. Охлажда се до стайна температура и последователно, при разбъркване се добавят 2 cm3 (ml) реактив Carrez I (4.11) и 2 cm3 (ml) реактив Carrez II (4.12).

6.3. Прибавя се разтвор на натриев хидроксид (4.3) за довеждане на рН до 8,3 с рН-метър (5.8). Съдържанието се прехвърля количествено в мерителна колба 250 cm3 (ml) и се долива до марката с дестилирана вода.

6.4. Съдържанието се разбърква и се филтрува през филтърна хартия (5.5).

6.5. С помощта на пипета (5.3) се прехвърля в мерителна колба 100 cm3 (ml) (5.2) не повече от 25 cm3 (ml) от бистрия филтрат (V). Долива се с дестилирана вода до обем 60 cm3 (ml).

6.6. След разбъркване се добавят 10,0 cm3 (ml) разтвор на сулфаниламид хидрохлорид (4.4) и след това 6,0 cm3 (ml) 5 N солна киселина (4.5). Разбърква се и се оставя да престои 5 min. Прибавят се 2,0 cm3 (ml) реактив N-1-нафтил (4.6), разбърква се и се оставя да престои 3 min. Долива се с вода до марката и се разбърква.

6.7. Приготвя се празна проба чрез повтаряне на операции 6.5 и 6.6 без прибавяне на реактив N-1-нафтил (4.6).

6.8. Измерва се (5.7) оптическата плътност при 538 nm на разтвора, получен съгласно 6.6 спрямо празната проба (6.7) като контрола.

6.9. По стандартна крива (6.10) се отчита съдържанието на натриев нитрит в mg/100 cm3 (ml) разтвор (М1), което съответства на отчетената оптическа плътност в 6.8.

6.10. Изготвя се стандартна крива, като се използва 10 mg/cm3 (ml) разтвор на натриев нитрит (4.2) за концентрации 0, 20, 40, 60, 80 и 100 mg натриев нитрит на 100 cm3 (ml).

7. Изчисление

Съдържанието на натриев нитрит в пробата в % (M/M) се изчислява с помощта на следната формула:

	250		100		M1
NaNO2 %=	_____________	x M1 x 10-6 x	_____________	=	_____________,
	V		M		V x M x 40

където:

M е масата на пробата, взета за анализ (6.1) в g;

M1 - съдържанието на натриев нитрит, определено съгласно 6.9 в mg;

V - филтратът, използван за измерването (6.5) в cm3 (ml).

8. Повторяемост (виж ISO 5725)

При съдържание на натриев нитрит около 0,2 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надхвърля абсолютна стойност 0,005 %.

ХI. Идентификация и определяне на свободен формалдехид

1. Област на приложение

Този метод описва идентификация и два начина за определяне съобразно присъствието или не на източници на формалдехид. Той е приложим за всички козметични продукти.

1.1. Идентификация

1.2. Общо колориметрично определяне с пентан-2,4-дион

Този метод е приложим, когато формалдехидът е използван самостоятелно или с други консерванти, които не са източници на формалдехид.

Когато това не е изпълнено или резултатите надвишават максимално допустимите концентрации, трябва да се използва следващият метод за потвърждение.

1.3. Определяне в присъствие на източници на формалдехид

В посочения в т. 1.2 метод по време на дериватизацията източниците на формалдехид се разцепват и това води до твърде завишени резултати (свързан или полимеризиран формалдехид).

Необходимо е да се отдели свободният формалдехид чрез течна хроматография.

2. Дефиниция

Съдържанието на свободен формалдехид в пробата, определено съгласно този метод, се изразява в % (M/M).

3. Идентификация

3.1. Принцип

Свободният и свързаният формалдехид в сярнокисела среда променят цвета на реактива на Schiff в розов или лилав.

3.2. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - дейонизирана.

3.2.1. Фуксин

3.2.2. Нaтриев сулфит кристалохидрат (Na2SO3.7H2O)

3.2.3. Концентрирана солна киселина (d420 = 1,19)

3.2.4. Сярна киселина - 1 М

3.2.5. Реактив на Schiff: 0,1 g фуксин (3.2.1) се претегля в чаша и се разтваря в 75 cm3 (ml) вода при 75 градуса С. След охлаждане се прибавят 2,5 g натриев сулфит (3.2.2). Долива се до 100 cm3 (ml). Използва се до две седмици.

3.3. Процедура

3.3.1. Претеглят се 2 g от пробата в стъклена чаша 10 cm3 (ml).

3.3.2. Прибавят се две капки сярна киселина (3.2.4) и 2 cm3 (ml) реактив на Schiff (3.2.5). При използване този реактив трябва да е абсолютно безцветен. Разклаща се и се оставя да престои 5 min.

3.3.3. Ако се наблюдава розово или лилаво оцветяване в рамките на 5 min, формалдехидът присъства в количество, по-голямо от 0,01 %, и трябва да се определи по метода за свободен и свързан формалдехид (4) и, ако е необходимо - по метод (5).

4. Общо колориметрично определяне с пентан- 2,4-дион

4.1. Принцип

Формалдехидът реагира с пентан-2,4-дион в присъствие на амониев ацетат, като образува 3,5-диацетил-1,4-дихидротолуидин. Той се екстрахира с бутан-1-ол и абсорбцията на екстракта се измерва при 410 nm.

4.2. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - дейонизирана.

4.2.1. Безводен амониев ацетат.

4.2.2. Концентрирана оцетна киселина, d420 = 1,05.

4.2.3. Пентан-2,4-дион, прясно дестилиран при намалено налягане 25 mm Hg, 25 градуса C - не трябва да има никаква абсорбция при 410 nm.

4.2.4. Бутан-1-ол.

4.2.5. Солна киселина - 1 М.

4.2.6. Солна киселина - 0,1 М.

4.2.7. Натриев хидроксид - 1 М.

4.2.8. Разтвор на скорбяла, приготвен непосредствено преди употреба, съгласно Европейската фармакопея (1g/50 cm3 (ml) вода), второ издание 1980, част I-VII-I-1.

4.2.9. Формалдехид - 37 % до 40 % (M/V).

4.2.10. Стандартен разтвор на йод - 0,05 М.

4.2.11. Стандартен разтвор на натриев тиосулфат - 0,1 М.

4.2.12. Реактив пентан - 2,4-дион:

В мерителна колба 1000 cm3 (ml) се разтварят: 150 g амониев ацетат (4.2.1), 2,0 cm3 (ml) пентан-2,4-дион (4.2.3) и 3,0 cm3 (ml) оцетна киселина (4.2.2). Обемът се довежда до марката с вода (рН на разтвора - около 6,4). Този реагент трябва да бъде приготвен непосредствено преди употреба.

4.2.13. Реактив (4.2.12) без пентан-2,4-дион.

4.2.14. Формалдехид-стандарт: основен разтвор

В мерителна колба 1000 cm3 (ml) се наливат 5 g формалдехид (4.2.9) и се долива с вода до марката.

Концентрацията на разтвора се определя, както следва:

Вземат се 10 cm3 (ml), прибавят се 25 cm3 (ml) от стандартния разтвор на йод (4.2.10) и 10 cm3 (ml) разтвор на натриев хидроксид (4.2.7). Оставя се да престои 5 min.

Подкислява се с 11 cm3 (ml) HCl (4.2.5) и се определя излишъкът от йод със стандартен разтвор на натриев тиосулфат (4.2.11), като се използва разтвор на скорбяла (4.2.8) като индикатор.

1,0 cm3 (ml) 0,05 M изразходван разтвор на йод (4.2.10) е еквивалентен на 1,5 mg формалдехид.

4.2.15. Формалдехид-стандарт: работен разтвор

Основният разтвор на формалдехид се разрежда последователно 1/20 и 1/100 с вода.

1,0 cm3 (ml) от този разтвор съдържа около 1,0 mg формалдехид.

Изчислява се точното съдържание.

4.3. Апаратура

4.3.1. Стандартно лабораторно оборудване.

4.3.2. Филтър за разделяне на фазите, Whatman 1 PS (или еквивалентен).

4.3.3. Центрофуга.

4.3.4. Водна баня, нагласена на 60 градуса С.

4.3.5. Спектрофотометър.

4.3.6. Стъклени кювети с оптичен път 1,0 cm.

4.4. Процедура

4.4.1. Подготовка на пробата:

В мерителна колба 100 cm3 (ml) се претегля с точност до 0,001g количество от пробата (g), съответстващо на предполагаемо съдържание на формалдехид около 150 mg. Долива се с вода до марката и се разбърква (разтвор С).

(Проверява се дали рН е близко до 6; ако не е, се разрежда с разтвор на солна киселина (4.2.6).

В ерленмайерова колба 50 cm3 (ml) се прибавят: 10 cm3 (ml) от разтвор С, 5 cm3 (ml) реактив пентан-2,4-дион (4.2.12) и дейонизирана вода до краен обем 30 cm3 (ml).

4.4.2. Сравнителен разтвор

Възможното влияние, дължащо се на фоновото оцветяване на изпитваната проба, се отстранява със следния сравнителен разтвор: в ерленмайерова колба 50 cm3 (ml) се прибавят: 10 cm3 (ml) от разтвор С, 5 cm3 (ml) реактив (4.2.13) и дейонизирана вода до краен обем 30 cm3 (ml).

4.4.3. Празна проба

В ерленмайерова колба 50 cm3 (ml) се прибавят: 5 cm3 (ml) реактив пентан-2,4-дион (4.2.12) и дейонизирана вода до краен обем 30 cm3 (ml).

4.4.4. Определяне

4.4.4.1. Смесите от 4.4.1, 4.4.2 и 4.4.3 се разклащат. Ерленмайеровите колби се потапят във водна баня при 60 градуса С точно за 10 min. Охлаждат се за 2 min в ледена баня.

4.4.4.2. Прехвърлят се в делителни фунии от 50 cm3 (ml), които съдържат по 10 cm3 (ml) бутан-1-ол (4.2.4). Всяка колба се промива с 3 до 5 cm3 (ml) вода. Сместа се разбърква енергично в продължение на точно 30 sec. Оставя се да се разслои.

4.4.4.3. Бутан-1-ол - фазата се филтрува в кюветите на спектрофотометъра през филтър за разделяне на фазите (4.3.2). Може да се използва и центрофугиране (3000 rpm за 5 min).

4.4.4.4. Измерва се абсорбцията А1 на пробата (4.4.1) спрямо стандарния разтвор (4.4.2) при 410 nm.

4.4.4.5. По същия начин се измерва абсорбцията А2 на празната проба (4.4.3) срещу бутан-1-ол.

Забележка: Всички тези операции трябва да бъдат проведени в рамките на 25 min от момента, в който ерленмайеровите колби са поставени във водната баня при 60 градуса С.

4.4.5. Стандартна крива

4.4.5.1. В ерленмайерова колба 50 cm3 (ml) се прибавят: 5 cm3 (ml) от разредения стандартен разтвор (4.2.15), 5 cm3 (ml) реактив пентан-2,4-дион (4.2.12) и дейонизирана вода до краен обем 30 cm3 (ml).

4.4.5.2. Продължава се, както е описано в 4.4.4, и се измерва абсорбцията срещу бутан-1-ол (4.2.4).

4.4.5.3. Процедурата се повтаря с 10, 15, 20 и 25 cm3 (ml) от разредения стандартен разтвор (4.2.15).

4.4.5.4. За получаване на нулевата стойност (съответстваща на оцветяването на реактивите) се процедира както в 4.4.4.5.

4.4.5.5. Построява се стандартна крива, след като от всяка от абсорбциите, получени в 4.4.5.1 и 4.4.5.3, се извади нулевата стойност.

Законът на Beer е валиден до 30 mg формалдехид.

4.5. Изчисления

4.5.1. Изважда се А2 от А1 и от стандартната крива (4.4.5.5) се отчита количеството С на формалдехида в разтвора на пробата (4.4.1) в mg.

4.5.2. Изчислява се количеството на формалдехида в пробата (% М/М) с помощта на следната формула:

	C
Съдържание на формалдехид в % =	________,
	103 x М

където:

М е масата на количеството за изпитване в g;

С - количеството на формалдехида в разтвора на пробата (4.4.1), отчетено от стандартната крива (4.4.5.5) в mg.

4.6. Повторяемост (виж ISO 5725)

За съдържание на формалдехид 0,2 % разликата между две успоредни определения, проведени с една и съща проба, не трябва да надхвърля 0,005 % за определянето по колориметричния метод с пентан-2,4-дион.

Ако определянето на свободен формалдехид води до резултати, по-високи от концентрациите, предвидени в Директива 76/768/ЕЕС, например:

a) между 0,05 % и 0,2 % неозначени в етикета на продукта;

b) по-високи от 0,2 % в продукт, независимо означен или не в етикета на продукта, трябва да бъде приложена процедурата съгласно т. 5.

5. Определяне в присъствието на източници на формалдехид

5.1. Принцип

Отделеният формалдехид се превръща в жълто лутидиново производно чрез реакция с пентан-2,4-дион в реактор след колоната и полученото производно се определя по абсорбцията при 420 nm.

5.2. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация за ВЕТХ.

5.2.1. Вода с качество за ВЕТХ или с еквивалентно качество.

5.2.2. Безводен амониев ацетат.

5.2.3. Концентрирана оцетна киселина.

5.2.4. Пентан-2,4-дион (съхраняван при 4 градуса С).

5.2.5. Безводен динатриев фосфат.

5.2.6. Ортофосфорна киселина - 85 % (d420 = 1,7).

5.2.7. Метанол с качество за ВЕТХ.

5.2.8. Дихлорметан.

5.2.9. Формалдехид - 37 до 40 % (W/V).

5.2.10. Натриев хидроксид - 1 М.

5.2.11. Солна киселина - 1 М.

5.2.12. Солна киселина - 0,002 М.

5.2.13. Разтвор на скорбяла, приготвен непосредствено преди употреба съгласно Европейската фармакопея (виж 4.2.8).

5.2.14. Стандартен разтвор на йод - 0,05 М.

5.2.15. Стандартен разтвор на натриев тиосулфат - 0,1 М.

5.2.16. Подвижна фаза: воден разтвор на динатриев фосфат (5.2.5), 0,006 М, доведен до рН 2,1 с ортофосфорна киселина (5.2.6).

5.2.17. Реактив за следколонна дериватизация: в мерителна колба 1000 cm3 (ml) се разтварят: 62,5 g амониев ацетат (5.2.2), 7,5 cm3 (ml) оцетна киселина (5.2.3) и 5 cm3 (ml) пентан-2,4-дион (5.2.4). Долива се до марката с вода (5.2.1). Този реактив се съхранява на тъмно. Време за съхранение: максимум 3 дни при 25 градуса С. Не трябва да се наблюдават промени в цвета.

5.2.18. Формалдехид-стандарт: основен разтвор

В мерителна колба 1000 cm3 (ml) се наливат 10 g формалдехид (5.2.9) и се долива с вода до марката. Концентрацията на разтвора се определя, както следва: вземат се 5 cm3 (ml) от разтвора, прибавят се 25 cm3 (ml) от стандартния разтвор на йод (5.2.14) и 10 cm3 (ml) разтвор на натриев хидроксид (5.2.10). Оставя се да престои 5 min. Подкислява се с 11 cm3 (ml) HCl (5.2.11) и се титрува излишъкът от стандартния разтвор на йод със стандартен разтвор на натриев тиосулфат (5.2.15), в присъствие на разтвор на скорбяла (5.2.13) като индикатор. 1 cm3 (ml) разтвор на йод (5.2.14) е еквивалентен на 1,5 mg формалдехид.

5.2.19. Формалдехид-стандарт: разреден разтвор

Основният разтвор се разрежда с подвижна фаза (5.2.16) до 1/100-на от неговата първоначална концентрация. 1 cm3 (ml) от този разтвор съдържа около 37 mg формалдехид. Изчислява се точното съдържание.

5.3. Апаратура

5.3.1. Стандартно лабораторно оборудване.

5.3.2. Помпа за ВЕТХ, без пулсации.

5.3.3. Помпа без пулсации за ниско налягане за реактивите (или втора ВЕТХ помпа).

5.3.4. Инжекционен дозаторен кран с 10 ml капиляра.

5.3.5. Следколонен реактор, състоящ се от следните компоненти:

- тригърлена колба от 1 dm3 (l),

- нагревател за колби от 1 dm3 (l),

- две колони Vigreux с минимум от 10 тарелки, с въздушно охлаждане,

- капиляра от неръждаема стомана (за топлообмен) 1,6 mm с вътрешен диаметър 0,23 mm, дължина 400 mm,

- тефлонова капиляра 1,6 mm с вътрешен диаметър 0,30 mm, дължина 5 m (френска плетка), виж допълнение 1,

- един Т-образен съединител без мъртъв обем (Valco или еквивалентен),

- три съединителя без мъртъв обем,

или: един следколонен модул Applied Biosystems PCRS 520 или еквивалентен, снабден с реактор от 1 cm3 (ml).

5.3.6. Мембранен филтър с размер на порите 0,45 mm.

5.3.7. SEP-PAKR С18 cartridge (филтриращ патрон) или еквивалентен.

5.3.8. Готови колони:

- Bischoff hypersil RP 18 - type NC ref. C 25.46 1805 (5 mm, дължина 250 mm, вътрешен диаметър 4,6 mm)

- Dupont Zorbax ODS (5 mm, дължина 250 mm, вътрешен диаметър 4,6 mm)

- Phase SEP, spherisorb ODS 2 (5 mm, дължина 250 mm, вътрешен диаметър 4,6 mm)

5.3.9. Предколона:

Bischoff К1 hypersil RP 18 - ref. К1 G 6301 1805 (5 mm, дължина 10 mm или еквивалентна).

5.3.10. Колоната и предколоната са свързани посредством система Ecotube (ref. A 15020508 Bischoff) или еквивалентна.

5.3.11. Апаратурата (5.3.5) се сглобява, както е показано на блок-схемата в допълнение 2.

Връзките след дозатора трябва да са възможно най-къси. Стоманената капиляра между изхода на реактора и входа на детектора е предназначена да охлажда реакционната смес преди измерването и температурата в детектора не е известна, но е постоянна.

5.3.12. Детектор за УВ и видимата област.

5.3.13. Пишещо устройство.

5.3.14. Центрофуга.

5.3.15. Ултразвукова вана.

5.3.16. Вибрационна бъркалка (Vortex или еквивалентна).

5.4. Принцип

5.4.1. Стандартна крива

Тя се получава чрез нанасяне на височините на пиковете като функция от концентрацията на разредения формалдехид-стандарт.

Приготвят се стандартни разтвори чрез разреждане на стандартния разтвор на формалдехид (5.2.19) с подвижна фаза (5.2.16): 1 cm3 (ml) разтвор (5.2.19), разреден до 20 cm3 (ml) (около 185 mg/100 cm3 (ml), 2 cm3 (ml) разтвор (5.2.19), разреден до 20 cm3 (ml) (около 370 mg/100 cm3 (ml), 5 cm3 (ml) разтвор (5.2.19), разреден до 25 cm3 (ml) (около 740 mg/100 cm3 (ml) и 5 cm3 (ml) разтвор (5.2.19), разреден до 20 cm3 (ml) (около 925 mg/100 cm3 (ml). Стандартните разтвори се съхраняват до 1 h при лабораторна температура и трябва да бъдат приготвени непосредствено преди употреба. Линейността на стандартната крива е добра за концентрации между 1 и 15 mg/cm3 (ml).

5.4.2. Приготвяне на пробите

5.4.2.1. Емулсии (кремове, база за гримове, очни линии)

В колба със запушалка 100 cm3 (ml) се претегля с точност до 0,001 g количество от пробата (М), съответстващо на предполагаемо количество формалдехид 100 mg. Прибавят се 20 cm3 (ml) дихлорметан (5.2.8) и 20 cm3 (ml) солна киселина (5.2.12), точно измерени. Разбърква се с вибрационна бъркалка (5.3.16) и с помощта на ултразвукова вана (5.3.15). Двете фази се разделят чрез центрофугиране (3000 rpm/2 min). Междувременно филтруващият патрон (5.3.7) се промива с 2 cm3 (ml) метанол (5.2.7), след което с 5 cm3 (ml) вода (5.2.1). 4 cm3 (ml) от водната фаза се пропуска през филтруващия патрон, отделят се първите 2 cm3 (ml), а останалата фракция се събира.

5.4.2.2. Лосиони, шампоани

В колба със запушалка 100 cm3 (ml) се претегля с точност до 0,001 g количество от пробата (М), съответстващо на предполагаемо количество формалдехид от 500 mg. Долива се с подвижна фаза (5.2.16) до 100 cm3 (ml). Разтворът се филтрува през филтър (5.3.6) и се инжектира или пропуска през филтруващия патрон (5.3.7), кондициониран както в 5.4.2.1. Всички разтвори трябва да се инжектират веднага след приготвянето им.

5.4.3. Хроматографски условия:

- Скорост на потока на подвижната фаза - 1 cm3 (ml)/min,

- Скорост на потока на реагента - 0,5 cm3 (ml)/min,

- Обща скорост на потока на изхода на детектора: 1,5 cm3 (ml)/min,

- Инжектиран обем - 10 ml,

- Температура на елуиране - в случай на трудно разделяне колоната се потапя в баня с топящ се лед; изчаква се температурата да се стабилизира (15 - 20 min),

- Температура на следколонния реактор - 100 градуса С,

- Детектор - 420 nm.

Забележка: Цялата хроматографска система и възелът след колоната трябва да са добре промити с вода след използване (5.2.1). Когато системата не се използва повече от два дни, тогава промиването с вода трябва да се последва от промиване с метанол (5.2.7). Преди рекондициониране на системата през нея се пропуска вода, за да се избегне кристализация.

5.5. Изчисления

Емулсии (5.4.2.1):

Съдържание на формалдехид в % (M/M):

C x 10-6 x 100		C x 10-4
_____________________________________________	=	____________.
5 x M		5 x M

Лосиони, шампоани:

В този случай формулата е:

C x 10-6 x 100		C x 10-4
_____________________________________________	=	____________,
M		M

където:

M e масата на анализираната проба (5.4.2.1) в g;

С - концентрацията на формалдехида, отчетена от стандартната крива (5.4.1) в mg/100 cm3 (ml).

5.6. Повторяемост (виж ISO 5725)

За съдържание на формалдехид 0,05 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надхвърля 0,001 %.

За съдържание на формалдехид 0,2 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надхвърля 0,005 %.

ДОПЪЛНЕНИЕ 1

ИНСТРУКЦИИ ЗА "ФРЕНСКА ПЛЕТКА"

Необходими принадлежности:

- дървена бобина: външен диаметър 5 cm с централен канал с диаметър 1,5 cm, забиват се четири стоманени пирона (както е показано на фиг. 1 и 2); разстоянието между два пирона трябва да е 1,8 cm и те трябва да са забити на 0,5 cm от отвора на канала,

- твърда игла (тип кука за плетене) за правене на бримки с тефлонова капиляра,

- 1,6 mm тефлонова капиляра с дължина 5 m и вътрешен диаметър 0,3 mm.

Процедура

За започване на "френска плетка" тефлоновата капиляра се прокарва през централния канал на бобината от горния към долния край (около 10 cm от капилярата да се показват от долния край на бобината, като така се дава възможност веригата да се издърпва по време на процеса на "плетене"); след това капилярата се увива последователно около четирите пирона, както е показано на фиг. 3.

Горната и долната части на "френска плетка" могат да са защитени с метални пръстени и затягащи винтове; трябва да се внимава да не се пречупи тефлоновата капиляра при силно издърпване. Капилярата се увива втори път около пирона и се правят "бримките", както следва:

- долната част на капилярата се прехвърля върху горната с помощта на куката (виж фиг. 4); този процес се повтаря за всеки пирон подред (1, 2, 3, 4 в посока, обратна на часовниковата стрелка) до получаване на 5 m или друга желана дължина на плетката.

Оставят се около 10 cm от капилярата за затваряне на веригата.

Капилярата се промушва през всяка от четирите бримки и леко се издърпва, за да се затвори краят на веригата.

Забележка: "Френска плетка" за следколонни реактори се продава на пазара (Supelco).

Фиг. 1

Фиг. 2

Фиг. 3. Първа капиляра

Фиг. 4. Втора капиляра

За получаване на "бримката" вдигнете долната капиляра (непрекъсната линия) върху втората капиляра (пунктирната линия).

Фиг. 5

ДОПЪЛНЕНИЕ 2

1.	НPLC-помпа	8.	Тригърлена колба с
2.	Инжектор		кипяща вода
3.	Колона с предколона	9.	Нагревател на колбата
4.	Помпа за реагенти	10.	Хладник
5.	Т-разклонител без мър-	11.	Стоманена топлооб-
	тъв обем		менна капиляра
5.	Т-разклонител (Vortex)	11x.	Топлообменник
6-6x.	Съединител без мъртъв	12.	UV-VIS-детектор
	обем	13.	Следколонен модул -
7.	"Френска плетка"		PCRS
7x.	Реактор

ХII. Определяне на резорцинол в шампоани и лосиони за коса

1. Област на приложение

Методът се отнася за газхроматографско определяне на резорцинол в шампоани и лосиони за коса. Методът е подходящ за концентрации в пробата от 0,1 % до 2,0 % (M/M).

2. Принцип

Резорцинол и 3,5-дихидрокситолуен (5-метилрезорцинол), добавени като вътрешен стандарт, се разделят от пробата чрез тънкослойна хроматография. Двете съединения се изолират чрез изстъргване на техните петна от плаката за тънкослойна хроматография и се екстрахират с метанол. След това екстрахираните съединения се изсушават, силилират и определят чрез газова хроматография.

3. Дефиниция

Съдържанието на резорцинол в пробата, определено по този метод, се изразява в % (M/M).

4. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.

4.1. Солна киселина - 25 % (V/V).

4.2. Метанол.

4.3. Етанол - 96 % (V/V).

4.4. Готови плаки за тънкослойна хроматография (пластмасови или алуминиеви) със силикагел с флуоресцентен индикатор. Дезактивират се, както следва: обикновени плаки с покритие от силикагел се напръскват с вода, докато повърхността им стане лъскава. Напръсканите плаки се оставят да изсъхнат на въздух при стайна температура в продължение на един до три часа.

Забележка: Ако плаките не са дезактивирани, може да има загуби на резорцинол поради необратимата му адсорбция върху силикагела.

4.5. Подвижна фаза: ацетон: хлороформ: оцетна киселина = 20:75:5 (V/V/V).

4.6. Стандартен разтвор на резорцинол - 400 mg резорцинол се разтварят в 100 cm3 (ml) 96 % етанол (4.3).

1 cm3 (ml) съответства на 4000 mg резорцинол.

4.7. Разтвор на вътрешен стандарт - разтварят се 400 mg 3,5-дихидрокситолуен (ДХТ) в 100 cm3 (ml) 96 % етанол (4.3). (1 cm3 (ml) съответства на 4000 mg ДХТ).

4.8. Стандартна смес - смесват се 10 cm3 (ml) разтвор 4.6 и 10 cm3 (ml) разтвор 4.7 в мерителна колба 100 cm3 (ml), долива се до марката с етанол (4.3) и се разбърква (1 cm3 от него съответства на 400 mg резорцинол и 400 mg ДХТ).

4.9. Силилиращи агенти:

4.9.1. N,O-бис-(триметилсилил)-трифлуорацетамид (БСТФАА).

4.9.2. Хексаметилдисилазан (ХMДС).

4.9.3. Триметилхлорсилан (TMХC).

5. Апаратура

5.1. Стандартно оборудване за тънкослойна и газова хроматография.

5.2. Стъклария.

6. Процедура

6.1. Приготвяне на пробата.

6.1.1. В стъклена чаша 150 cm3 (ml) се претегля проба за анализ, с точност до 0,001 g, която съдържа приблизително 20 до 50 mg резорцинол.

6.1.2. Подкислява се със солна киселина (4.1), докато сместа стане кисела (необходими са около 2 до 4 cm3 (ml), прибавят се 10 cm3 (ml) от разтвора на вътрешния стандарт (4.7) и се разбърква. Прехвърля се в мерителна колба 100 cm3 (ml) с етанол (4.3), долива се до марката с етанол и се разбърква.

6.1.3. Нанасят се 250 ml от разтвора (6.1.2) върху плаката с дезактивиран силикагел (4.4) като непрекъсната линия с дължина около 8 cm. Внимава се линията да е възможно тънка.

6.1.4. Нанасят се 250 ml от стандартната смес (4.8) на същата плака по същия начин (6.1.3).

6.1.5. На две точки от стартовата линия се накапват по 5 ml от всеки от стандартните разтвори 4.6 и 4.7, за да се улесни локализирането след проявяването на плаката.

6.1.6. Хроматограмата се развива в ненаситена вана, заредена с подвижна фаза (4.5). След достигане на фронта (12 cm), за около 45 min, плаката се изважда и изсушава на въздух. Локализира се зоната резорцинол/ДХТ на късовълнова УВ-светлина (254 nm). Двата компонента имат приблизително еднакви Rf-стойности. Ивиците се отбелязват с молив на 2 mm разстояние от тяхната външна тъмна гранична линия. Тези зони се изстъргват и адсорбентът от всяка ивица се събира в шише от 10 cm3 (ml).

6.1.7. Адсорбентът, съдържащ пробата, и адсорбентът, съдържащ стандартната смес, се екстрахират по следния начин: прибавят се 2 cm3 (ml) метанол (4.2) и се екстрахира 1 h при непрекъснато бъркане. Сместа се филтрува и екстракцията се повтаря за още 15 min с 2 cm3 (ml) метанол.

6.1.8. Екстрактите се обединяват и разтворителят се изпарява чрез изсушаване за една нощ във вакуум-ексикатор, зареден с подходящ сушител. Не се прилага никакво загряване.

6.1.9. Остатъците (6.1.8) се силилират, както е посочено в 6.1.9.1 или в 6.1.9.2.

6.1.9.1. С помощта на микроспринцовка се прибавят 200 ml БСТФАА (4.9.1) и сместа се оставя да престои в затворен съд в продължение на 12 h при стайна температура.

6.1.9.2. С помощта на микроспринцовка се прибавят последователно 200 ml ХMДС (4.9.2) и 100 ml TMХC (4.9.3) и сместа се загрява в продължение на 30 min при tградуса = 60 градуса С в затворен съд. Сместа се охлажда.

6.2. Газова хроматография.

6.2.1. Хроматографски условия.

Колоната трябва да има разделителна способност R, равна или по-добра от 1,5:

	2 dў (r2 - r1)
R =	______________,
	w1 + w2

където:

r1 и r2 са времената на задържане на двата пика в min;

w1 и w2 - широчините на същите пикове при половината от височината в mm;

dў - скоростта на хартията в mm/min.

Подходящи са следните газхроматографски условия:

- Колона	материал	неръждаема стомана
	дължина	200 cm
	вътрешен диаметър	около 3 mm
	пълнеж	10 % OV-17 върху
		Chromosorb WAW,
		100 до 120 mesh

- Пламъчно-йонизационен детектор

Температури:

колона:	185 градуса С (изотермичен режим)
детектор:	250 градуса С
инжектор:	250 градуса С
- Газ-носител	азот
поток:	45 cm3 (ml)/min

Потокът на водорода и въздуха се съобразява съгласно Инструкцията към апарата.

6.2.2. Инжектират се 1 до 3 ml от разтворите, получени съгласно 6.1.9. За всеки разтвор (6.1.9) се правят по 5 инжектирания, измерват се площите на пиковете, данните се осредняват и се изчислява отношението между площите на пиковете:

S - площта на пика на резорцинола/площта на пика на ДХT.

7. Изчисление

Концентрацията на резорцинол в пробата се изчислява по следната формула:

	4		Sпроба
% резорцинол =	_____________	x	_________________,
	M		Sстандартна смес

където:

М e количество на пробата (6.1.1) в g;

Sпроба - средното съотношение на площите на пиковете съгласно 6.2.2 за разтвора на пробата;

Sстандартна смес - средното съотношение на площите на пиковете съгласно 6.2.2 за стандартната смес.

8. Повторяемост (виж ISO 5725)

При съдържание на резорцинол около 0,5 % разликата между резултатите от две успоредни определяния, проведени с една и съща проба, не трябва да надхвърля абсолютна стойност 0,025 %.

ХIII. Определяне на метанол във връзка с етанол и пропан-2-ол

1. Област на приложение

Методът се отнася за газхроматографско определяне на метанол във всички козметични продукти (вкл. аерозоли).

Могат да се определят относителни количества до 10 %.

2. Дефиниция

Количеството метанол, определено по този метод, се изразява в % (M/M) на метанола във връзка с етанол или пропан-2-ол.

3. Принцип

Определянето се извършва чрез газова хроматография.

4. Реактиви

Използват се реактиви с квалификация "за газова хроматография".

4.1. Метанол.

4.2. Етанол.

4.3. Пропан-2-ол.

4.4. Хлороформ, свободен от алкохоли чрез промиване с вода.

5. Апаратура

5.1. Газхроматограф с детектори:

5.1.1. Катарометричен детектор за аерозолни проби.

5.1.2. Пламъчно-йонизационен детектор за неаерозолни проби.

5.2. Мерителни колби - 100 сm3 (ml).

5.3. Пипети от 2 сm3 (ml), 20 сm3 (ml) от 0 до 1 сm3 (ml).

5.4. Микроспринцовки от 0 до 100 ml и от 0 до 5 ml и газови спринцовки (само за аерозолни проби - виж процедурата за вземане на проби съгласно т. II. Лабораторно приготвяне на пробите за изпитване, фиг. 5).

6. Процедура

6.1. Подготовка на пробите

6.1.1. Проби от аерозолни продукти се приготвят в съответствие с т. II. Лабораторно приготвяне на пробите за изпитване и след това се анализират хроматографски при условията съгласно т. 6.2.1. от настоящия метод.

6.1.2. Проби от неаерозолни продукти се приготвят в съответствие с т. II. Лабораторно приготвяне на пробите за изпитване, като се разреждат с вода до съдържание на етанол или пропан-2-ол в пробата около 1 - 2 % и след това се анализират газхроматографски при условията от 6.2.2.

6.2. Газхроматографски анализ

6.2.1. За аерозолни проби

6.2.1.1. Детектор-катарометър

6.2.1.2. Колоната с 10 % Hallcomid М18 върху Chromosorb WAW 100 до 200 mesh или еквивалентна. Колоната трябва да има разделителна способност (R), равна или по-голяма от 1,5.

Разделителната способност се изчислява по формулата:

	dxr2 - dxr1
R = 2	_____________,
	w1 + w2

където:

r1 и r2 са времената на задържане на двата пика в min;

w1 и w2 - широчините на същите пикове при половината от височината в mm;

dx - скоростта на хроматограмата в mm/min.

6.2.1.3. Условия на газхроматографското определяне:

- Колона:	материал - неръждаема стомана
	дължина - 3,5 m
	диаметър - 3,0 mm

- Катарометричен мост - 150 mA

- Газ носител - хелий

	налягане - 2,5 бара
	скорост на потока - 45 cm3/min

- Температура на инжектора - 150 градуса С

- Температура на детектора - 150 градуса С

- Температура на колоната - 65 градуса С

Измерванията на пиковите площи могат да се подобрят чрез електронно интегриране.

6.2.2. За неаерозолни проби:

6.2.2.1. Детектор - пламъчнойонизационен.

6.2.2.2. Колона с Chromosorb 105 или Porapak QS. Колоната трябва да има разделителна способност (R), равна или по-голяма от 1,5.

Разделителната способност се изчислява по формулата:

	dxr2 - dxr1
R = 2	_____________,
	w1 + w2

където:

r1 и r2 са времената на задържане на двата пика в min;

w1 и w2 - широчините на същите пикове при половината от височината в mm;

dx - скоростта на хроматограмата в mm/min.

6.2.2.3. Условия на газхроматографското определяне:

- Колона:	материал - неръждаема стомана
	дължина - 2,0 m
	диаметър - 3,0 mm

- Чувствителност на електрометъра - 8 x 10-10А

- Газ носител - азот

	налягане - 2,1 бара
	скорост на потока - 40 cm3/min

- Помощен (допълнителен) газ - водород

	налягане - 1,5 бара
	скорост на потока - 20 cm3/min

- Температура на инжектора - 150 градуса С

- Температура на детектора - 230 градуса С

- Температура на колоната - 120 до 130 градуса С

7. Стандартна крива

7.1. За газхроматографска процедура 6.2.1 (колона Hallcomid М18) се използват стандартни смеси, посочени в табл.1.

В мерителни колби 100 cm3 (ml) се отмерват по 20 cm3 (ml) етанол и се добавя метанол, както е посочено в табл. 1.

Точното количество на метанола се определя чрез претегляне на пипетата преди и след всяко дозиране.

Таблица 1

Съдържание	Метанол	Етанол или	Хлороформ
на метанол	сm3 (ml)	пропан-	сm3 (ml),
в пробата		2-ол сm3 (ml)	добавен до
(М/М %)			обем
Приблизително 2,5 %	0,5	20	100
Приблизително 5,0 %	1,0	20	100
Приблизително 7,5 %	1,5	20	100
Приблизително 10,0 %	2,0	20	100

От стандартните смеси се инжектират от 2 до 3 ml и хроматографският анализ се провежда съгласно условията от 6.2.1.

Изчисляват се съотношенията на пиковите площи (метанол/етанол) или (метанол/пропан-2-ол) на всяка смес. Начертава се стандартна крива при координати:

Х-ос: % метанол във връзка с етанол или пропан-2-ол.

У-ос: съотношение на пиковите площи (метанол/етанол) или (метанол/пропан-2-ол).

7.2. За газхроматографска процедура 6.2.2 (Porapak QS или Chromosorb 105) се използват стандартни смеси, посочени в табл. 2.

Тези смеси се приготвят чрез измерване с микроспринцовка и пипета. Точното количество се измерва чрез непосредствено претегляне на пипетата след всяко добавяне.

Таблица 2

Съдържание	Метанол	Етанол или	Вода
на метанол	(ml)	пропан-	сm3 (ml),
в пробата		2-ол сm3 (ml)	добавена
(М/М %)			до обем
Приблизително 2,5 %	50	2	100
Приблизително 5,0 %	100	2	100
Приблизително 7,5 %	150	2	100
Приблизително 10,0 %	200	2	100

Инжектират се 2 до 3 ml в хроматографа, като се използват условията от 6.2.2.

Изчисляват се съотношенията на пиковите площи (метанол/етанол) или (метанол/пропан-2-ол) на всяка смес. Начертава се стандартна графика:

Х-ос: % метанол във връзка с етанол или пропан-2-ол.

У-ос: съотношение на пиковите площи (метанол/етанол) или (метанол/пропан-2-ол).

7.3. Стандартната крива трябва да има линеен характер.

8. Повторяемост

За 5 % съдържание на метанол, във връзка с етанол или пропан-2-ол, разликата в резултатите от две паралелни определения, извършени с една и съща проба, не трябва да надвишават 0,25 %.

ХIV. Определяне на дихлорметан и 1,1,1-трихлоретан

1. Област на приложение

Методът се отнася за определянето на дихлорметан (метиленхлорид) и 1,1,1-трихлоретан (метилхлороформ) във всички козметични продукти, които вероятно могат да съдържат тези разтворители.

2. Дефиниция

Съдържанието на дихлорметан и 1,1,1-трихлоретан в пробата, определени по този метод, се изразяват в % (M/M).

3. Принцип

Определянето се извършва чрез газова хроматография с хлороформ като вътрешен стандарт.

4. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация за "газова хроматография".

4.1. Хлороформ (CHCl3).

4.2. Тетрахлорметан (CCl4).

4.3. Дихлорметан (CH2Cl2).

4.4. 1,1,1-трихлоретан (CH3CCl3).

4.5. Ацетон.

4.6. Азот.

5. Апаратура

5.1. Стандартно лабораторно оборудване.

5.2. Газхроматограф с катарометър.

5.3. Бутилка за прехвърляне - 50 - 100 сm3 (ml) (виж т. II. Лабораторно приготвяне на пробите за изпитване, 5.2).

5.4. Спринцовка за газ под налягане - 25 или 50 ml (виж т. II. Лабораторно приготвяне на пробите за изпитване, 5.3.2.2).

6. Процедура

6.1. Проба, която не е под налягане: в конична колба със запушалка се претегля проба с точност 0,001 g. Прибавя се точно претеглено количество хлороформ (4.1) като вътрешен стандарт, еквивалентно на предполагаемото количество дихлорметан или 1,1,1-трихлоретан, съдържащо се в пробата. Разбърква се добре.

6.2. Проба под налягане: използва се методът за взeмане на проби, описан в т. II. Лабораторно приготвяне на пробите за изпитване, но със следните уточнения:

6.2.1. След прехвърляне на пробата в бутилката за прехвърляне (5.3) в нея се въвежда като вътрешен стандарт определен обем хлороформ (4.1), еквивалентен на предполагаемото количество дихлорметан или 1,1,1-трихлоретан, съдържащ се в пробата. Разбърква се добре. Мъртвият обем на вентила се промива с 0,5 сm3 (ml) тетрахлорметан (4.2). След изсушаване по разликата се определя точната маса на прибавения вътрешен стандарт.

6.2.2. След напълване на спринцовката с проба накрайникът на спринцовката се продухва с азот (4.6), така че да няма остатъци преди инжектиране в хроматографа.

6.2.3. След вземане на всяка проба повърхността на вентила и съда за прехвърляне трябва да се промият няколко пъти с ацетон (4.5) (използвайки, както се изисква, спринцовка за подкожни инжекции) и след това се подсушават напълно с азот (4.6).

6.2.4. За всеки анализ се правят измервания с използване на две различни бутилки за прехвърляне и се правят по пет измервания за бутилка.

7. Хроматографски условия

7.1. Предколона

Тръба - неръждаема стомана.

Дължина - 300 mm.

Диаметър - 3 или 6 mm.

Пълнеж - същия материал, както в аналитичната колона.

7.2. Колона

Стационарната фаза е приготвена от Hallcomid M18 върху Chromosorb.

Колоната трябва да показва разделяне R, равно или по-голямо от 1,5, като:

	dx(r2 - r1)
R = 2	_____________,
	W1 + W2

където:

r1 и r2 са времена на задържане на двата пика;

W1 и W2 - широчините на същите пикове при половината от височината;

dx - скоростта на хартията в mm/min.

Като примери следните колони дават желаните резултати:

Колона	I	II
Материал	Стоманена тръба	Стоманена тръба
Дължина	350 сm	400 сm
Диаметър	3 mm	6 mm
Носител
Chromosorb	WAW	WAW-ДМЦС-HP
Ситов анализ	100 - 120 mesh	60 - 80 mesh
Стационарна	Hallcomid M18	Hallcomid M18,20 %
фаза	10 %

Температурните условия могат да се различават в зависимост от апарата. За горните примери те са нагласени, както следва:

Колона	I	II
Температури
Kолона	65 градуса C	75 градуса C
Инжектор	150 градуса C	125 градуса C
Детектор	150 градуса C	200 градуса C
Газ-носител
Дебит на потока от	45 сm3	60 сm3
хелий	(ml)/min	(ml)/min
Налягане на входа	2,5 bar	2 bar
Инжектирана проба	15 ml	15 ml

8. Смес за определяне на корекционните коефициенти

В конична колба със запушалка се приготвя следната точно претеглена смес:

Дихлорметан (4.3) - 30 % (М/М).

1,1,1-трихлоретан (4.4) - 35 % (М/М).

Хлороформ (4.1) - 35 % (М/М).

9. Изчисления

9.1. Изчисляване на корекционния коефициент на вещество "р" спрямо вещество "а", избрано като вътрешен стандарт:

Нека първото вещество е "р", за което:

kp е неговият корекционен коефициент;

Мp - неговата маса в сместа;

Ap - площта на неговия пик.

Нека второто вещество е "а", за което:

ka - неговият корекционен коефициент (приравнява се на 1);

Ma - неговата маса в сместа;

Aa - площта на неговия пик.

Тогава:

	Мp x Aa
kp =	_________.
	Мa x Ap

Като пример бяха получени следните корекционни коефициенти (за хлороформа k = 1):

Дихлорметан:	k1 = 0,78 +/- 0,03
1,1,1-трихлоретан:	k2 = 1,00 +/- 0,03

9.2. Изчисляване на % (М/М) на дихлорметан и 1,1,1-трихлоретан, присъстващи в анализираната проба

Нека:

Мa е масата на въведения хлороформ в g;

Ms - масата на анализираната проба в g;

Aa - площта на пика на хлороформа;

A1 - площта на пика на дихлорметана;

A2 - площта на пика на 1,1,1-трихлоретана,

тогава:

	Мa x A1 x k1 x 100
%(M/M)CH2Cl2 =	___________________,
	Aa x Ms

	Мa x A2 x k2 x 100
%(M/M)CH3CCl3 =	_________________,
	Aa x Ms

10. Повторяемост (виж ISO 5725)

За съдържание на дихлорметан и/или 1,1,1-трихлоретан от 25 % (М/М) разликата между резултатите от две успоредни определения, извършени на една и съща проба, не трябва да превишава по абсолютна стойност 2,5 % (М/М).

ХV. Идентификация и определяне на хинолин-8-ол и бис (8-хидроксихинолиниев) сулфат

1. Област на приложение

Методът се отнася за идентификация и количествено определяне на хинолин-8-ол и неговия сулфат.

2. Дефиниция

Съдържанието на хинолин-8-ол и бис (8-хидроксихинолиниев) сулфат в пробата, определени по този метод, се изразява в % (M/M) като хинолин-8-ол.

3. Принцип

3.1. Идентификация

Идентификация чрез тънкослойна хроматография.

3.2. Определяне

Определянето се провежда чрез спектрофотометриране на комплекса, получен при реакция с Fehling разтвор, при 410 nm.

4. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.

4.1. Хинолин-8-ол.

4.2. Бензен.

Поради неговата токсичност трябва да се внимава много при работата с бензен.

4.3. Хлороформ.

4.4. Натриев хидроксид - 50 % (M/M).

4.5. Меден сулфат пентахидрат.

4.6. Калиево-натриев тартарат.

4.7. Солна киселина - 1 М.

4.8. Сярна киселина - 0,5 М.

4.9. Натриев хидроксид - 1 М.

4.10. Етанол.

4.11. Бутан-1-ол.

4.12. Ледена оцетна киселина.

4.13. Солна киселина - 0,1 М.

4.14. Целит 545 или еквивалентен.

4.15. Стандартни разтвори.

4.15.1. В мерителна колба 100 сm3 (ml) се претеглят 0,1 g хинолин-8-ол (4.1) с точност 0,001 g. Разтваря се в малко сярна киселина (4.8). Долива се до марката със сярна киселина (4.8) и се разбърква.

4.15.2. В мерителна колба 100 сm3 (ml) се претеглят 0,1 g хинолин-8-ол (4.1) с точност 0,001 g. Разтваря се в етанол (4.10). Долива се до марката с етанол (4.10) и се разбърква.

4.16. Fehling разтвор

Разтвор А

В мерителна колба 100 сm3 (ml) се претеглят 7 g меден сулфат пентахидрат (4.5). Разтваря се в малко вода. Долива се до марката с вода и се разбърква.

Разтвор Б

В мерителна колба 100 сm3 (ml) се претеглят 35 g калиево-натриев тартарат (4.6). Разтваря се в 50 сm3 (ml) вода. Прибавят се 20 сm3 (ml) натриев хидроксид (4.4). Долива се до марката с вода и се разбърква.

Непосредствено преди работа с пипета се вземат 10 сm3 (ml) от разтвор А и 10 сm3 (ml) от разтвор Б и се поставят в мерителна колба 100 сm3 (ml). Долива се до марката и се разбърква.

4.17. Подвижни фази за тънкослойна хроматография:

I. Бутан-1-ол (4.11) : оцетна киселина (4.12) : вода = 80:20:20 (V/V/V).

II. Хлороформ (4.13) : оцетна киселина (4.12) = 95:5 (V/V).

4.18. 2,6-дихлор-4-(хлоримино)циклохекса-2,5-диенон, 1 % (M/V) разтвор в етанол (4.10).

4.19. Натриев карбонат - 1 % (M/V).

4.20. Етанол (4.10) - 30 % (V/V).

4.21. Динатриев дихидрогенетилендиаминтетраацетат - 5 % (M/V).

4.22. Буферен разтвор - рН 7.

В мерителна колба 1 dm3 (l) се претеглят 27 g безводен калиев дихидрогенортофосфат и 70 g дикалиев хидрогенортофосфат трихидрат. Долива се с вода до марката.

4.23. Готови плаки за тънкослойна хроматография.

Готови плаки за тънкослойна хроматография с дебелина 0,25 mm (Kieselgel 60 "Merck" или еквивалентни). Преди употреба се напръскват с 10 сm3 (ml) реактив (4.21) и се сушат при 80 градуса С.

5. Апаратура

5.1. Облодънна колба с гърло на шлиф - 100 сm3 (ml).

5.2. Мерителни колби.

5.3. Градуирани пипети - 10 и 5 сm3 (ml).

5.4. Фол-пипети - 20, 15, 10 и 5 сm3 (ml).

5.5. Делителни фунии - 100, 50 и 25 сm3 (ml).

5.6. Нагъната филтърна хартия с диаметър 90 mm.

5.7. Ротационен изпарител.

5.8. Обратен хладник с шлиф.

5.9. Спектрофотометър.

5.10. Кювети с дебелина на слоя 10 mm.

5.11. Бъркалка с нагряване.

5.12. Стъклена хроматографска колона с размери: дължина 160 mm и диаметър 8 mm, с тампон от стъклен памук в долния край и адаптер за прилагане на налягане в горния край.

6. Процедура

6.1. Идентификация

6.1.1. Течни проби

6.1.1.1. Довежда се рН на част от пробата за изпитване до 7, след което от нея се нанасят 5 и 10 ml върху стартовата линия на предварително третираната плака за тънкослойна хроматография (4.23).

6.1.1.2. Накапват се 10 и 30 ml от стандартния разтвор (4.15.2) на още две точки на стартовата линия, след което плаката се поставя в една от двете подвижни фази (4.17).

6.1.1.3. Когато фронтът на разтворителя се придвижи на 15 сm, плаката се суши при 110 градуса С (за 15 min). Петната на хинолин-8-ол флуоресцират в жълт цвят при УВ-светлина (366 nm).

6.1.1.4. Плаката се напръсква с разтвор на натриев карбонат (4.19). Изсушава се и се напръсква с разтвор на 2,6-дихлор-4-(хлоримино)циклохекса-2,5-диенон (4.18). Хинолин-8-олът се проявява като синьо петно.

6.1.2. Твърди проби или кремове

6.1.2.1. Един грам от пробата се диспергира в 5 сm3 (ml) буферен разтвор (4.22) и се разклаща. След това се прехвърля с 10 сm3 (ml) хлороформ (4.3) в делителна фуния и се разклаща. След отделяне на хлороформения слой водният слой се екстрахира още два пъти с по 10 сm3 (ml) хлороформ (4.3). Обединените и филтрувани хлороформени екстракти се изпаряват почти до сухо в облодънна колба 100 сm3 (ml) (5.1) на ротационен изпарител (5.7). Остатъкът се разтваря в 2 сm3 (ml) хлороформ (4.3) и от получения разтвор се нанасят 10 и 30 ml върху плака за тънкослойна хроматография със силикагел (4.23) съгласно метода, описан в т. 6.1.1.1.

6.1.2.2. Нанасят се 10 и 30 ml от стандартния разтвор (4.15.2) на плаката и се продължава по начина, описан от т. 6.1.1.2 до т. 6.1.1.4.

6.2. Определяне

6.2.1. Течни проби

6.2.1.1. В облодънна колба 100 сm3 (ml) се претеглят 5 g от пробата с точност 0,001 g, прибавят се 5 сm3 (ml) разтвор на сярна киселина (4.8) и сместа се изпарява почти до сухо при понижено налягане и температура 50 градуса С.

6.2.1.2. Остатъкът се разтваря в 20 сm3 (ml) топла вода. Прехвърля се в мерителна колба 100 сm3 (ml). Промива се три пъти с по 20 сm3 (ml) вода. Долива се до марката с вода и се разбърква.

6.2.1.3. С пипета се вземат 5 сm3 (ml) от разтвора и се поставят в делителна фуния 50 сm3 (ml) (5.5). Прибавят се 10 сm3 (ml) Fehling разтвор (4.16). Медният комплекс на хинолин-8-ола [оксин мед (ISO)] се екстрахира три пъти с по 8 сm3 (ml) хлороформ (4.3).

6.2.1.4. В мерителна колба 25 сm3 (ml) (5.2) се събират обединените и филтрирани хлороформени извлеци. Колбата се долива до марката с хлороформ (4.3) и се разклаща. Измерва се оптическата плътност на оцветения в жълт цвят разтвор срещу хлороформ при 410 nm.

6.2.2. Твърди проби или кремове

6.2.2.1. В облодънна колба 100 сm3 (ml) (5.1) се претеглят 0,500 g от пробата с точност 0,001 g. Прибавят се 30 сm3 (ml) бензен (4.2) и 20 сm3 (ml) солна киселина (4.7). Съдържанието на колбата се кипи 30 min на обратен хладник при разбъркване.

6.2.2.2. Съдържанието на колбата се прехвърля в делителна фуния 100 сm3 (ml) (5.5). Промива се с 5 сm3 (ml) 1 N солна киселина (4.7). Водната фаза се прехвърля в облодънната колба (5.1), а бензеновият слой се промива с 5 сm3 (ml) солна киселина (4.7).

6.2.2.3. В случай че се получи емулсия, която затруднява по-нататъшната обработка, 0,500 g от пробата се смесва с 2 g целит 545 (4.14) за получаване на свободно сипещ се прах. Сместа се прехвърля на малки порции в стъклена хроматографска колона (5.12).

След всяко прибавяне пълнежът на колоната се набива. След като цялата смес се прехвърли в колоната, тя се елуира със солна киселина (4.13), така че 10 сm3 (ml) елуат да се получат за около 10 min (ако е необходимо, елуирането може да се проведе под слабо налягане от азот). По време на елуирането трябва да е сигурно, че над пълнежа на колоната винаги има известно количество солна киселина. Първите 10 сm3 (ml) от елуата се обработват по-нататък, както е описано в т. 6.2.2.4.

6.2.2.4. Събраните водни фази (6.2.2.2) или елуатът (6.2.2.3) се изпаряват почти до сухо на ротационен вакуум изпарител.

6.2.2.5. Остатъкът се разтваря в 6 сm3 (ml) разтвор на натриев хидроксид (4.9). Прибавят се 20 сm3 (ml) Fehling разтвор (4.16) и съдържанието се прехвърля от колбата в делителна фуния 50 сm3 (ml) (5.5). Колбата се промива с 8 сm3 (ml) хлороформ (4.3). Разклаща се и хлороформеният слой се филтрува в мерителна колба 50 сm3 (ml) (5.2).

6.2.2.6. Екстракцията се повтаря три пъти с по 8 сm3 (ml) хлороформ (4.3). Хлороформените фази се филтруват и се събират в мерителната колба от 50 сm3 (ml). Допълва се до марката с хлороформ (4.3) и се разклаща. Измерва се оптическата плътност на оцветения в жълт цвят разтвор при 410 nm спрямо хлороформ (4.3).

7. Стандартна крива

В четири облодънни колби 100 сm3 (ml) (5.1), всяка от които съдържа 3 сm3 (ml) 30 % разтвор на етанол (4.20), се поставят с пипета 5, 10, 15 и 20 сm3 (ml) порции от стандартния разтвор (4.15.1), съответстващи на 5, 10, 15 и 20 mg хинолин-8-ол. Процедира се, както е описано в 6.2.1.

8. Изчисления

8.1. Течни проби

	a
Съдържание на хинолин-8-ол %(М/М) =	___	x 100,
	M

където:

a е хинолин-8-ол в mg, отчетено от стандартната крива (7);

М - масата на изпитваната проба (6.2.1.1) в mg.

8.2. Твърди проби или кремове

	2a
Съдържание на хинолин-8-ол %(М/М) =	_____________	x 100,
	M

където:

a е хинолин-8-ол в mg, отчетено от стандартната крива (7);

М - масата на изпитваната проба (6.2.2.1) в mg.

9. Повторяемост (виж ISO 5725)

За съдържание на хинолин-8-ол от около 0,3 % разликата между резултатите от две успоредни изпитвания, проведени с една и съща проба, не трябва да надхвърля по абсолютна стойност 0,02 %.

ХVI. Определяне на амоняк

1. Област на приложение

Определяне на свободен амоняк в козметични продукти.

2. Дефиниция

Съдържанието на амоняк в анализираната проба, определено по този метод, е изразено в % (M/M).

3. Принцип

Към разредената във водно-метанолова среда анализирана проба се добавя разтвор на бариев хлорид. Утайката, която може да се образува, се филтрува или центрофугира. Така по време на парната дестилация се избягва загубата на амоняк от някои амониеви соли като карбонат и бикарбонат (хидроген карбонат) и тези на мастните киселини, с изключение на амониев ацетат. Амонякът се отделя от филтрата с парна дестилация. Определя се потенциометрично или чрез друго титруване.

4. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.

4.1. Метанол

4.2. Бариев хлорид дихидрат - 25 % (M/V)

4.3. Ортоборна киселина - 4 % (M/V)

4.4. Сярна киселина - 0,25 М

4.5. Антиразпенваща течност

4.6. Натриева основа - 0,5 М

4.7. Индикатор при обратно титруване: смесват се 5 сm3 (ml) 0,1 % (M/V) разтвор на метилрот в етанол с 2 сm3 (ml) 0,1 % (M/V) воден разтвор на метиленово синьо

5. Апаратура

5.1. Стандартно лабораторно оборудване

5.2. Центрофуга с добре затварящи се епруветки 100 сm3 (ml)

5.3. Дестилационен апарат

5.4. Потенциометър

5.5. Измерващ стъклен електрод и сравнителен каломелов електрод

6. Процедура

6.1. В мерителна колба 100 сm3 (ml) се претегля с точност 0,001 g проба (М), съответстваща на 150 mg максимално количество амоняк.

6.2. Прибавят се 10 сm3 (ml) вода, 10 сm3 (ml) метанол (4.1) и 10 сm3 (ml) разтвор на бариев хлорид (4.2). Долива се до 100 сm3 (ml) с метанол (4.1).

6.3. Разбърква се и се оставя за една нощ в хладилник (5 градуса C).

6.4. Все още студеният разтвор се филтрува или се центрофугира за 10 min в епруветки (5.2), за да се получи бистър филтрат.

6.5. В парния дестилатор (5.3) последователно се отпепетирват 40 сm3 (ml) от този разтвор и 0,5 сm3 (ml) антиразпенваща течност (4.5).

6.6. Дестилирането продължава, докато се събере приблизително 200 сm3 (ml) дестилат в бехерова чаша 250 сm3 (ml), съдържаща 10 сm3 (ml) стандартна сярна киселина (4.4) и 0,1 сm3 (ml) индикатор (4.7).

6.7. Излишъкът от киселина се титрува със стандартен разтвор на натриева основа (4.6).

6.8. Забележка: При потенциометричното определяне дестилирането се извършва, като за приемник на дестилата се използва бехерова чаша 250 сm3 (ml), съдържаща 25 сm3 (ml) ортоборна киселина (4.3). Дестилирането продължава, докато се събере 200 сm3 (ml) дестилат. Титрува се с разтвора на сярна киселина (4.4), като се записва кривата на неутрализация (кривата на титруване).

7.Изчисления

7.1. Изчисления в случай на обратно титруване (остатъчно титруване)

	(20М2 - V1M1) x 17 x 100		(20М2 - V1M1) x 4250
амоняк % (М/М)=	_______________________________________________________________________________________________	=	_______________________,
	0,4M		M

където:

V1 е обемът натриева основа (4.6), изразходван при титруването в сm3 (ml);

М1 - неговата моларност (4.6);

М2 - моларността на разтвора на сярната киселина (4.4);

М - масата на анализираната проба (6.1) в mg.

7.2. Изчисления в случай на директно потенциометрично титруване

	V2 x M2 x 17 x 100		4250 V2M2
амоняк % (М/М)=	______________________________________________________________________________	=	_________________,
	0,4M		M

където:

V2 е обемът разтвор на сярна киселина, изразходвани при титруването в сm3 (ml);

М2 - моларността на разтвора на сярната киселина, използвана при титруването (4.4);

M - масата на анализираната проба в mg.

8. Повторяемост (виж ISO 5725)

При съдържание на амоняк около 6 % разликата между резултатите на две паралелно извършени определения на една и съща проба не трябва да надвишават абсолютната стойност 0,6 %.

ХVII. Идентификация и определяне на нитрометан

1. Област на приложение

Този метод се отнася за идентификация и определяне на нитрометан до около 0,3 % в козметични продукти в аерозолни опаковки.

2. Дефиниция

Съдържанието на нитрометан, определено по този метод, се изразява в % (M/M) нитрометан в цялото съдържание на аерозолната опаковка.

3. Принцип

Нитрометанът се идентифицира чрез цветна реакция. Нитрометанът се определя газхроматографски след добавяне на вътрешен стандарт.

4. Идентификация

4.1. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.

4.1.1. Натриев хидроксид, 0,5 М разтвор.

4.1.2. Реактив на Folin

Разтварят се 0,1 g натриев 3,4-дихидро-3,4-диоксонафтален-1-сулфонат във вода и се разрежда до 100 сm3 (ml).

4.2. Процедура

Към 1 сm3 (ml) от пробата се прибавят 10 сm3 (ml) от 4.1.1 и 1 сm3 (ml) от 4.1.2. Виолетово оцветяване показва наличието на нитрометан.

5. Определяне

5.1. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "за газова хроматография".

5.1.1. Хлороформ (вътрешен стандарт 1).

5.1.2. 2,4-диметилхептан (вътрешен стандарт 2).

5.1.3. Етанол - 95 %.

5.1.4. Нитрометан.

5.1.5. Разтвор на хлороформ (вътрешен стандарт).

В тарирана мерителна колба 25 сm3 (ml) се претеглят около 0,65 g хлороформ с точност 0,001 g (5.1.1). Долива се до 25 сm3 (ml) с 95 % етанол (5.1.3). Претегля се и се изчислява съдържанието на хлороформ в този разтвор в % (M/M).

5.1.6. Разтвор на 2,4-диметилхептан (вътрешен стандарт).

Приготвя се по същия начин както разтвора на хлороформ, като се претеглят 0,27 mg 2,4-диметилхептан с точност 0,001 g (5.1.2) в мерителна колба 25 сm3 (ml).

5.2. Апаратура

5.2.1. Газхроматограф с пламъчно-йонизационен детектор.

5.2.2. Апаратура за вземане на проби от аерозолни опаковки (бутилка за прехвърляне, микроспринцовки и др.), съгласно т. II. Лабораторно приготвяне на пробите за изпитване.

5.2.3. Стандартно лабораторно оборудване.

5.3. Процедура

5.3.1. Приготвяне на пробата

В тарирана 100 сm3 (ml) бутилка за прехвърляне, почистена и вакуумирана съгласно начина, описан в т. II. Лабораторно приготвяне на пробите за изпитване (5.3), се поставят около 5 сm3 (ml) от разтворите на вътрешен стандарт (5.1.5 или 5.1.6). Използва се стъклена спринцовка от 10 или 20 сm3 (ml) без игла, приспособена към бутилката за прехвърляне, следвайки процедурата, описана в т. II. Лабораторно приготвяне на пробите за изпитване (5). Претегля се отново, за да се определи поставеното количество. Използвайки същата процедура, в бутилката се прехвърлят около 50 g от съдържанието на пробата в аерозолната опаковка. Отново се претегля, за да се определи количеството на прехвърлената проба. Разбърква се добре.

Инжектират се около 10 ml с посочената микроспринцовка (5.2.2). Правят се пет инжектирания.

5.3.2. Приготвяне на стандарта

В мерителна колба 50 сm3 (ml) се претеглят с точност 0,001 g около 0,5 g нитрометан (5.1.4), 0,5 g хлороформ (5.1.1) или 0,21 g 2,4-диметилхептан (5.1.2). Долива се до марката с 95 % етанол (5.1.3). Разбърква се добре. В мерителна колба 20 сm3 (ml) се поставят 5 сm3 (ml) от този разтвор. Долива се до марката с 95 % етанол (5.1.3).

Инжектират се около 10 ml с посочената микроспринцовка (5.2.2). Правят се пет инжектирания.

5.3.3. Газхроматографски условия

5.3.3.1. Колона

Състои се от две части: първата - с пълнеж от дидецилфталат върху Gas Chrom Q, а втората - Ucon 50 HB 280X върху Gas Chrom Q. Приготвената комбинирана колона трябва да дава разделяне R, равно или по-добро от 1,5, като:

	dx(r2 - r1)
R = 2	_____________,
	W1 + W2

където:

r1 и r2 са времената на задържане на двата пика в min;

W1 и W2 - широчините на същите пикове при половината от височината в mm;

dx - скоростта на хартията в mm/min.

Като пример, следните две части дават желаното разделяне:

Колона А:

Материал - неръждаема стомана.

Дължина - 1,5 m.

Диаметър - 3 mm.

Пълнеж - 20 % дидецилфталат върху Gas Chrom Q (100 - 120 mesh).

Колона Б:

Материал - неръждаема стомана.

Дължина - 1,5 m.

Диаметър - 3 mm.

Пълнеж - 20 % Ucon 50 HB 280X върху Gas Chrom Q (100 - 120 mesh).

5.3.3.2. Детектор

Подходяща чувствителност за електрометъра на пламъчно-йонизационния детектор е 8 x 10-10А.

5.3.3.3. Температурни условия

Подходящи са следните условия:

Инжектор - 150 градуса С.

Детектор - 150 градуса С.

Колона - между 50 и 80 градуса С в зависимост от използваните колони и апарата.

5.3.4. Подаване на газове

Газ-носител - азот.

Налягане - 2,1 bar.

Дебит на потока - 40 сm3 (ml)/min.

Захранване на детектора - както е посочено от производителя на детектора.

6. Изчисления

6.1. Корекционен коефициент на нитрометан, изчислен спрямо използвания вътрешен стандарт

Ако с "n" се означи нитрометанът:

нека:

kn е неговият корекционен коефициент;

Мxn - неговата маса в сместа в g;

Sxn - площта на неговия пик.

Ако с "с" се означи вътрешният стандарт, хлороформ или 2,4-диметилхептан:

нека:

Мxc е неговата маса в сместа в g;

Sxc - площта на неговия пик,

тогава:

	Мxn		Sxc
kn=	_____________	x	_____________
	Мxc		Sxn

(kn - функцията от апарата).

6.2. Концентрация на нитрометан в пробата

Ако с "n" се означи нитрометанът:

нека:

kn е неговият корекционен коефициент;

Sn - площта на неговия пик.

Ако с "с" се означи вътрешният стандарт, хлороформ или 2,4-диметилхептан:

нека:

Мc е неговата маса в сместа в g;

Sc - площта на неговия пик;

М - масата на прехвърления аерозол в g,

тогава % (M/M) на нитрометана в пробата е:

Мc		Kn x Sn
___	x	___________________	x 100.
M		Sc

7. Повторяемост (виж ISO 5725)

За съдържание на нитрометан от около 0,3 % (M/M) разликата между две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,03 % (M/M).

ХVIII. Идентификация и определяне на меркаптооцетна киселина в продукти за къдрене и изправяне на косата и депилатоари

1. Област на приложение

Методът се отнася за идентификация и определяне на меркаптооцетна киселина в продукти за къдрене и изправяне на косата и депилатоари, в които могат да присъстват и други редуциращи агенти.

2. Дефиниция

Съдържанието на меркаптооцетна киселина в пробата, определено съгласно този метод, се изразява в % (М/М) меркаптооцетна киселина.

3. Принцип

Меркаптооцетната киселина се идентифицира чрез капков анализ и тънкослойна хроматография и се определя чрез йодометрия или газхроматография.

4. Идентификация

4.1. Идентификация чрез капков анализ

4.1.1. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.

4.1.1.1. Индикаторна хартия с оловен диацетат.

4.1.1.2. Разтвор на солна киселина 1:1 (V/V).

4.1.2.1. Идентификация на меркаптооцетна киселина чрез цветна реакция с индикаторна хартия с оловен диацетат.

Една капка от пробата за анализ се поставя върху индикаторна хартия с оловен диацетат (4.1.1.1.). Ако се появи интензивно жълто оцветяване, вероятно присъства меркаптооцетна киселина.

Чувствителност - 0,5 %.

4.1.2.2. Характеризиране на неорганични сулфиди чрез образуване на сероводород при подкисляване.

В епруветка се поставят няколко mg от пробата за анализ. Прибавят се 2 сm3 (ml) дестилирана вода и 1 сm3 (ml) солна киселина (4.1.1.2). Отделеният сероводород, който се познава по миризмата, образува черна утайка от оловен сулфид върху индикаторна хартия с оловен диацетат (4.1.1.1).

Чувствителност - 50 ppm.

4.1.2.3. Характеризиране на сулфити чрез образуване на серен диоксид при подкисляване.

Постъпва се, както е описано в 4.1.2.2. Довежда се до кипене. Серният диоксид се разпознава по неговия мирис и чрез редукционните му свойства, например по отношение към перманганатни йони.

4.2. Идентификация с тънкослойна хроматография.

4.2.1. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.

4.2.1.1. Меркаптооцетна киселина (тиогликолова киселина) - 98 % минимална чистота, определена йодометрично.

4.2.1.2. 2,2x-дитиоди (оцетна) киселина - 99 % минимална чистота, определена йодометрично.

4.2.1.3. 2-меркаптопропионова киселина (тиомлечна киселина) - 95 % минимална чистота, определена йодометрично.

4.2.1.4. 3-меркаптопропионова киселина - 98 % минимална чистота, определена йодометрично.

4.2.1.5. 3-меркаптопропан-1,2-диол (1-тиоглицерол) - 98 % минимална чистота, определена йодометрично.

4.2.1.6. Готови плаки за тънкослойна хроматография със силикагел - дебелина на слоя 0,25 mm.

4.2.1.7. Готови плаки за тънкослойна хроматография с алуминиев оксид, Merck F254 или еквивалентни.

4.2.1.8. Солна киселина, концентрирана - d420 = 1,19 g/cm3 (ml)

4.2.1.9. Етилацетат.

4.2.1.10. Хлороформ.

4.2.1.11. Диизопропилов етер.

4.2.1.12. Тетрахлорметан.

4.2.1.13. Ледена оцетна киселина.

4.2.1.14. Калиев йодид - 1 % (М/V) разтвор във вода.

4.2.1.15. Платинов тетрахлорид - 0,1 % (М/V) разтвор във вода.

4.2.1.16. Подвижни фази.

4.2.1.16.1. Етилацетат (4.2.1.9) : хлороформ (4.2.1.10) : диизопропилов етер (4.2.1.11): оцетна киселина (4.2.1.13) = 20:20:10:10 (V/V/V/V).

4.2.1.16.2. Хлороформ (4.2.1.10) : оцетна киселина (4.2.1.13) = 90:20 (V/V).

4.2.1.17. Реактиви за проявяване на петната.

4.2.1.17.1. Непосредствено преди употреба се смесват равни обеми от разтвор (4.2.1.14) и разтвор (4.2.1.15).

4.2.1.17.2. Разтвор на бром - 5 % (М/V) : 5 g бром се разтварят в 100 сm3 (ml) тетрахлорметан (4.2.1.12).

4.2.1.17.3. Разтвор на флуоресцеин - 0,1 % (М/V): 100 mg флуоресцеин се разтварят в 100 сm3 (ml) етанол.

4.2.1.17.4. Хексаамониев хептамолибдат - 10 % (М/V) разтвор във вода.

4.2.1.18. Стандартни разтвори.

4.2.1.18.1. Меркаптооцетна киселина (4.2.1.1) - 0,4 % (М/V) разтвор във вода.

4.2.1.18.2. 2,2x-дитиоди (оцетна киселина) (4.2.1.2) - 0,4 % (М/V) разтвор във вода.

4.2.1.18.3. 2-меркаптопропионова киселина (4.2.1.3) - 0,4 % (М/V) разтвор във вода.

4.2.1.18.4. 3-меркаптопропионова киселина (4.2.1.4) - 0,4 % (М/V) разтвор във вода.

4.2.1.18.5. 3-меркаптопропан-1,2-диол (4.2.1.5) - 0,4 % (М/V) разтвор във вода.

4.2.2. Апаратура.

Стандартна апаратура за тънкослойна хроматография.

4.2.3. Процедура

4.2.3.1. Подготовка на пробите

Пробата се подкислява с няколко капки солна киселина (4.2.1.8) до pH 1 и ако е необходимо, се филтрува.

В някои случаи може да се препоръча разреждане на пробата. Ако се процедира по този начин, подкисляването със солна киселина се извършва преди разреждането.

4.2.3.2. Хроматографиране

Върху плаката се нанася 1 ml от разтвора на пробата (4.2.3.1) и по 1 ml от всеки от сравнителните разтвори (4.2.1.18). Внимателно се изсушава на слаб ток от азот и хроматограмата се развива в подвижната фаза (4.2.1.16.1 или 4.2.1.16.2). Плаката се изсушава възможно най-бързо, за да се избегне окислението на тиолите.

4.2.3.3. Проявяване на петната.

Плаката се напръсква с един от трите реактива (4.2.1.17.1, 4.2.1.17.3 или 4.2.1.17.4). Ако плаката се напръска с реактив 4.2.1.17.3, след това се обработва с бромни пари (например във вана, съдържаща малка чаша с реактив 4.2.1.17.2), докато петната станат видими. Оцветяването с реактива за напръскване (4.2.1.17.4) ще бъде задоволително само ако времето за изсушаване на слоя не надхвърля 30 min.

4.2.3.4. Интерпретация

Сравняват се Rf-стойностите и цветът на петната на стандартните разтвори и тези на пробата. Средните Rf-стойности, дадени по-долу, са за груба ориентация и имат само сравнителна стойност. Те зависят от:

- степента на активност на тънкия слой по време на хроматографирането,

- температурата на хроматографската вана.

Примерни Rf-стойности, получени

на слой силикагел

Подвижни фази

	4.2.1.16.1	4.2.1.16.2
Меркаптооцетна киселина	0,25	0,80
2-меркаптопропионова киселина	0,40	0,95
2,2x-дитиоди (оцетна) киселина	0,00	0,35
3-меркаптопропионова киселина	0,45	0,95
3-меркаптопропан-1,2-диол	0,45	0,35

5. Определяне

Определянето винаги трябва да започва с йодометричния метод.

Забележка: Определянето на меркаптооцетна киселина трябва да бъде проведено на неизползван продукт от прясно отворени опаковки, за да се предотврати окислението.

5.1. Йодометрично определяне.

5.1.1. Принцип

Определянето се осъществява чрез окисление на "-SH" групата с йод в кисела среда съгласно уравнението:

2HOOC - CH2SH + J2 (r) (HOOC - CH2 - S)2 + 2J - + 2H+.

5.1.2. Реактиви

Йод - 0,05 М стандартен разтвор.

5.1.3. Апаратура

Стандартно лабораторно оборудване.

5.1.4. Процедура

Претегля се 0,5 до 1 g от пробата с точност 0,001 g в конична колба 150 сm3 (ml) със запушалка, съдържаща 50 сm3 (ml) дестилирана вода. Прибавят се 5 сm3 (ml) солна киселина (4.1.1.2) (pH на разтвора - около 0) и се титрува с разтвор на йод (5.1.2) до поява на жълто оцветяване. Ако е необходимо, се използва индикатор (например разтвор на скорбяла или тетрахлорметан).

5.1.5. Изчисления

Съдържанието на меркаптооцетната киселина се изчислява по формулата:

	92 x n x 100		0,92 x n
% (M/M) =	__________________________________________	=	_____________,
	1000 x 10 x M		M

където: М е масата на пробата за анализ в g;

n - използваният обем от разтвор на йод в сm3 (ml).

5.1.6. Забележки:

Ако резултатът, изчислен като меркаптооцетна киселина, е 0,1 % или повече под разрешената максимална концентрация, тогава не е необходимо да се провеждат по-нататъшни определяния.

Ако резултатът е равен или е над разрешения максимум на концентрацията и идентификацията е показала присъствие на няколко редуциращи агента, тогава е необходимо да се проведе газхроматографско определяне.

5.2. Газова хроматография.

5.2.1. Принцип

Меркаптооцетната киселина се отделя от другите съставки на продукта чрез утаяване с разтвор на кадмиев диацетът. След метилиране с диазометан, приготвен in situ или предварително в разтвор на диетилов етер, метиловото производство на меркаптооцетната киселина се определя чрез газотечна хроматография при използване на метилоктаноат като вътрешен стандарт.

5.2.2. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "за газова хроматография", а водата - бидестилирана.

5.2.2.1. Меркаптооцетна киселина - 98 %.

5.2.2.2. Солна киселина - d420 = 1,19 g/cm3 (ml)

5.2.2.3. Метанол.

5.2.2.4. Кадмиев диацетат дихидрат - 10 % (М/V).

5.2.2.5. Метилоктаноат - 2 % (М/V) разтвор в метанол.

5.2.2.6. Ацетатен буферен разтвор (pH 5):

Натриев ацетат трихидрат - 77 g.

Ледена оцетна киселина - 27,5 g.

Деминерализирана вода за получаване на краен обем от 1 1.

5.2.2.7. Солна киселина - 3 М разтвор в метанол (5.2.2.3), приготвен непосредствено преди употреба.

5.2.2.8. 1-метил-3-нитро-1-нитрозогуанидин.

5.2.2.9. Натриев хидроксид - 5 М разтвор.

5.2.2.10. Йод - 0,05 М стандартен разтвор.

5.2.2.11. Диетилов етер.

5.2.2.12. Разтвор на диазометан, приготвен от н-метил-н-нитрозотолуен-4-сулфонамид (Fieser, Reagents for Organic Synthesis (Wiley), 1967).

Полученият разтвор съдържа около 1,5 g диазометан в 100 сm3 (ml) диетилов етер. Тъй като диазометанът е токсичен и твърде нестабилен газ, всички експерименти трябва да се провеждат в мощна камина и да се избягва използването на стъклария на шлиф (има специални комплекти за тази цел).

5.2.3. Апаратура

5.2.3.1. Стандартно лабораторно оборудване.

5.2.3.2. Апарат за получаване на диазометан за метилиране in situ (виж Fales, Н.М., Jaouni,Т.М. and Babashak, J.F., Analyt. Chem. 1973, 45,2302).

5.2.3.3. Апаратура за предварително получаване на диазометан (Fieser).

5.2.4. Приготвяне на пробата

В центрофужна епруветка 50 сm3 (ml) се претегля достатъчно количество от пробата с точност 0,001 g, което да съдържа предполагаемо количество от 0,05 до 0,007 g меркаптооцетна киселина.

Подкислява се с няколко капки солна киселина (5.2.2.2), за да се получи pH около 3.

Прибавят се 5 сm3 (ml) деминерализирана вода и 10 сm3 (ml) ацетатен буферен разтвор (5.2.2.6).

Проверява се дали pH е около 5 с хартиен pH-индикатор. След това се прибавят 5 сm3 (ml) разтвор на кадмиев диацетат (5.2.2.4).

Изчакват се 10 min и след това се центрофугира поне 15 min при 4000 rpm. Отстранява се бистрата течност, която може да съдържа неразтворими мазнини (в случай на кремообразни продукти). Тези мазнини не трябва да се бъркат с тиолите, които се събират като компактна маса на дъното на епруветката. Проверява се да няма утаяване при прибавяне на няколко капки разтвор на кадмиев диацетат (5.2.2.4) към бистрата течност.

Ако при предварителната идентификация не е открито присъствие на редуциращи агенти, различни от тиолите, йодометрично се проверява дали присъстващите в бистрата течност тиоли не надхвърлят 6 до 8 % от първоначалното количество.

В центрофужната епруветка, съдържаща утайката, се поставят 10 cm3 (ml) метанол (5.2.2.3) и утайката се диспергира фино чрез разбъркване със стъклена пръчка. Отново се центрофугира поне 15 min при 4000 rpm. Бистрата течност се отлива и се проверява за отсъствие на тиоли.

Утайката се промива втори път по същия начин.

В същата епруветка се добавят:

- 2 cm3 (ml) разтвор на метилоктаноат (5.2.2.5),

- 5 cm3 (ml) солна киселина в метанол (5.2.2.7).

Тиолите се разтварят напълно (малко неразтворимо вещество от пълнителя може да остане). Това е разтвор "С".

С аликвотна част от този разтвор се проверява йодометрично дали съдържанието на тиоли е поне 90 % от това, получено по т. 5.1.

5.2.5. Метилиране

Метилирането се провежда или чрез процедура in situ (5.2.5.1), или с предварително приготвен разтвор на диазометан (5.2.5.2).

5.2.5.1. Метилиране in situ

В апарата за метилиране (5.2.3.2), съдържащ 1 cm3 (ml) етер (5.2.2.11), се въвеждат 50 ml разтвор "С" и се метилира по методика (5.2.3.2) с около 300 mg 1-метил-3-нитро-1-нитрозогуанидин (5.2.2.8). След 15 min (етерният разтвор трябва да е жълт, което показва излишък от диазометан) разтворът на пробата се прехвърля в шишенце 2 cm3 (ml) с херметична запушалка. Оставя се в хладилник за една нощ. Едновременно се метилират две проби.

5.2.5.2. Метилиране с предварително приготвен разтвор на диазометан.

В колба 5 cm3 (ml) със запушалка се поставя 1 cm3 (ml) разтвор на диазометан (5.2.2.12) и след това 50 ml разтвор "С". Оставя се за една нощ в хладилник.

5.2.6. Приготвяне на стандарта

Приготвя се стандартен разтвор от меркаптооцетна киселина (5.2.2.1) с позната концентрация, съдържащ около 0,06 g чиста меркаптооцетна киселина (5.2.2.1) в 2 cm3 (ml).

Това е разтвор "Е".

Утаява се, проверява се и се метилира, както е описано в 5.2.4 и 5.2.5.

5.2.7. Газхроматографски условия

5.2.7.1. Колона

Тип - неръждаема стомана.

Дължина - 2 m.

Диаметър - 3 mm.

5.2.7.2. Пълнеж 20 % дидецилфталат/хромосорб WAW, 80 до 100 mesh.

5.2.7.3. Детектор

Пламъчно-йонизационен. Подходяща чувствителност за електрометъра на пламъчно-йонизационния детектор е 8 x 10-10 А.

5.2.7.4. Газове

Газ-носител - азот.

Налягане - 2,2 bar.

Дебит на потока - 35 cm3 (ml)/min.

Допълнителен газ - водород.

Налягане - 1,8 bar.

Дебит на потока - 15 cm3 (ml)/min.

Захранване на детектора - както е посочено от производителите на апарата.

5.2.7.5. Температурни условия

Инжектор - 200 градуса С

Детектор - 200 градуса С

Колона - 90 градуса С.

5.2.7.6. Скорост на хартията на самописеца - 5 mm/min.

5.2.7.7. Количество за инжектиране - 3 ml. Правят се пет инжектирания.

5.2.7.8. Хроматографските условия са дадени като указание. Те осигуряват разделяне R, равно или по-добро от 1,5, като:

	dx(r2 - r1)
R = 2	_____________,
	W1 + W2

където: r2 и r1 са времена на задържане в min;

W1 и W2 - широчините на пиковете при половината от височините им в mm;

dx - скорост на хартията в mm/min.

Препоръчва се хроматографирането да завърши с повишаване на температурата от 90 до 150 градуса С при скорост 10 градуса С/min, за да се елиминира възможността за влияние на лабилните вещества при следващите хроматографирания.

5.2.8. Изчисления

5.2.8.1. Коефициент на пропорционалност на меркаптооцетната киселина. Той е изчислен по отношение на метилоктаноат на базата на стандартна смес.

Ако с "t" се означи меркаптооцетната киселина:

нека:

kt е нейният корекционен коефициент;

Мxt - нейната маса в сместа в g;

Sxt - площта на нейния пик.

Ако с "с" се означи метилоктаноата:

нека:

Мxс е неговата маса в сместа в mg;

Sxc - площта на неговия пик,

тогава:

	Мx		Sxc
kt=	_____________	x	___.
	Мxc		Sxt

Този коефициент варира според използваната апаратура.

5.2.8.2. Концентрация на меркаптооцетната киселина в пробата.

Ако с "t" се означи меркаптооцетната киселина:

нека:

kt е нейният корекционен коефициент;

St - площта на нейния пик.

Ако с "с" се означи метилоктаноата:

нека:

Мс е неговата маса в сместа в mg;

Sc - площта на неговия пик;

М - масата на първоначалната проба за изпитване в mg,

тогава % (М/М) на меркаптооцетната киселина в пробата е:

Мxc		kt x St
___	x	___________________	x 100.
M		Sc

7. Повторяемост (виж ISO 5725)

За съдържание на меркаптооцетна киселина 8 % (М/М) разликата между две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,8 % (М/М).

ХIХ. Идентификация и определяне на хексахлорофен

A. Идентификация

1. Област на приложение

Методът е подходящ за всички козметични продукти.

2. Принцип

Хексахлорофенът се екстрахира с етилацетат и се идентифицира чрез тънкослойна хроматография.

3. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.

3.1. Сярна киселина - 4 М.

3.2. Целит AW.

3.3. Етилацетат.

3.4. Подвижна фаза - бензен, съдържащ 1 % (V/V) ледена оцетна киселина.

3.5. Реактив за проявяване на петната I:

Разтвор на родамин В: разтварят се 0,1 g родамин B в смес от 150 сm3 (ml) диетилов етер, 70 сm3 (ml) абсолютен етанол и 16 сm3 (ml) вода.

3.6. Реактив за проявяване на петната II:

Разтвор на 2,6-дибром-4-(хлоримино)циклохекса-2,5-диенон: разтварят се 0,4 g 2,6-дибром-4-(хлоримино)циклохекса-2,5-диенон в 100 сm3 (ml) метанол, приготвен непосредствено преди употреба.

Разтвор на натриев карбонат - разтварят се 10 g натриев карбонат в 100 сm3 (ml) деминерализирана вода.

3.7. Стандартен разтвор:

Хексахлорофен - 0,05 % (M/V) разтвор в етилацетат.

4. Апаратура

4.1. Плаки за тънкослойна хроматография Кизелгел F254, 20 x 20 сm или еквивалентни.

4.2. Стандартно оборудване за тънкослойна хроматография.

4.3. Термостатирана при 26 градуса С водна баня, в която се слага хроматографската вана.

5. Приготвяне на пробата за изпитване

5.1. Смесват се добре 1 g от хомогенизираната проба с 1 g целит AW (3.2) и 1 сm3 (ml) сярна киселина (3.1).

5.2. Суши се 2 h при 100 градуса С.

5.3. Охлажда се и сухият остатък се стрива на фин прах.

5.4. Екстрахира се двукратно с по 10 сm3 (ml) етилацетат (3.3), центрофугира се след всяка екстракция и етилацетатните слоеве се обединяват.

5.5. Изпарява се при 60 градуса С.

5.6. Остатъкът се разтваря в 2 сm3 (ml) етилацетат (3.3).

6. Процедура

6.1. Върху плаката за тънкослойна хроматография се нанасят 2 ml от разтвора на пробата за изпитване и 2 ml от сравнителния разтвор.

6.2. Хроматографската вана се насища с подвижната фаза (3.4).

6.3. Плаката за тънкослойна хроматография се поставя във ваната и хроматограмата се развива, докато фронтът на разтворителя се придвижи на 15 сm.

6.4. Плаката се изважда и се суши в сушилня с вентилатор при около 105 градуса С.

6.5. Проявяване на петната

Петната от хексахлорофена се оцветяват, както е посочено в 6.5.1 или в 6.5.2.

6.5.1. Плаката се напръсква равномерно с проявяващ реактив I (3.5). След 30 min плаката се разглежда на УВ-лампа при l=254 nm.

6.5.2. Плаката се напръсква равномерно с разтвор на 2,6-дибром-4-(хлоримино) циклохекса-2,5-диенон - проявяващ реактив II (3.6). След това плаката се напръсква с разтвор на натриев карбонат (3.6). Плаката се суши 10 min при стайна температура, след което се разглежда на дневна светлина.

7. Интерпретация

7.1. Проявяващ реактив I (3.5):

Хексахлорофенът се наблюдава като синкаво петно на жълто-оранжев флуоресциращ фон и има Rf-стойност около 0,5.

7.2. Проявяващ реактив II (3.6):

Хексахлорофенът се наблюдава като небесносиньо до тюркоазено петно на бял фон и има Rf-стойност около 0,5.

Б. Определяне

1. Област на приложение

Този метод е приложим за всички козметични продукти.

2. Дефиниция

Съдържанието на хексахлорофен в пробата, определено по този метод, се изразява като % (M/M) хексахлорофен.

3. Принцип

След превръщане в метилово производно хексахлорофенът се определя чрез газова хроматография с електрон-улавящ детектор.

4. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "за газова хроматография".

4.1. Етилацетат.

4.2. н-метил-н-нитрозо-п-толуенсулфонамид (diazald).

4.3. Диетилов етер.

4.4. Метанол.

4.5. 2-(2-етоксиетокси) етанол (карбитол).

4.6. Мравчена киселина.

4.7. Калиев хидроксид - 50 % (M/M) воден разтвор. Приготвя се непосредствено преди употреба.

4.8. Хексан, за спектроскопия.

4.9. Бромхлорофен (стандарт № 1).

4.10. 4,4x,6,6x-тетрахлор-2,2x-тиодифенол (стандарт № 2).

4.11. 2,4,4x-трихлор-2-хидрокси-дифенилов етер (стандарт № 3).

4.12. Ацетон.

4.13. Сярна киселина - 4 М.

4.14. Целит AW.

4.15. Мравчена киселина / етилацетат - 10 % (V/V) разтвор.

4.16. Хексахлорофен.

5. Апаратура

5.1. Стандартно лабораторно оборудване.

5.2. Миниапарат за получаване на диазометан (Analyt. Chem., 1973, 45, 2302-2).

5.3. Газов хроматограф с електрон-улавящ детектор, с Ni63-източник.

6. Процедура

6.1. Приготвяне на стандартен разтвор

Стандартът се подбира така, че да не взаимодейства с никое вещество, съдържащо се в пълнителя на анализирания продукт. Обикновено най-подходящ е стандарт № 1 (4.9).

6.1.1. В мерителна колба 100 cm3 (ml) се претеглят с точност 0,001 g около 50 mg от стандарт № 1, 2 или 3 (4.9, 4.10 или 4.11) и 0,05 g хексахлорофен (4.16) от 100 сm3 (ml). Долива се до марката с етилацетат (4.1) (разтвор А). 10 сm3 (ml) от разтвор А се разрежда до 100 сm3 (ml) с етилацетат (4.1) (разтвор Б).

6.1.2. В мерителна колба 100 сm3 (ml) се претеглят с точност 0,001 g около 0,05 g от стандарт № 1, 2 или 3 (4.9, 4.10 или 4.11). Долива се до марката с етилацетат (4.1) (разтвор В).

6.2. Приготвяне на пробата (виж ISO 5725)

Претегля се 1 g от хомогенизираната проба с точност 0,001 g и се смесва напълно с 1 сm3 (ml) сярна киселина (4.13), 15 сm3 (ml) ацетон (4.12) и 8 g целит AW (4.14). Сместа се суши до въздушно сухо състояние на парна баня за 30 min, след което се суши за 1 h и 30 min в сушилня с вентилатор. Охлажда се, остатъкът се стрива на фин прах и се прехвърля в стъклена колона. Елуира се с етилацетат (4.1) и се събират 100 сm3 (ml). Прибавят се 2 сm3 (ml) от разтвора на вътрешния стандарт (разтвор Б) (6.1.2).

6.3. Метилиране на пробата

Апаратчето и всички реактиви за получаване на диазометан се охлаждат до 0 градуса - 4 градуса С в продължение на 2 h. Във външното отделение на апаратчето се поставят 1,2 сm3 (ml) от разтвора, получен в 6.2, и 0,1 сm3 (ml) метанол (4.4). В централния резервоар се поставят около 0,2 g диазалд (4.2) и се разтваря чрез добавяне на 1 сm3 (ml) карбитол (4.5) и 1 сm3 (ml) диетилов етер (4.3).

Апаратчето се сглобява, потапя се наполовина в ледена баня при 0 градуса С и в централния резервоар се впръсква със спринцовка 1 сm3 (ml) охладен разтвор на калиев хидроксид (4.7). Трябва да се провери дали полученото жълто оцветяване от образуващия се диазометан е трайно. Ако жълтото оцветяване не е трайно, метилирането се повтаря с нови 0,2 g диазалд (4.2) (Трайността на жълтото оцветяване е указание за излишък на диазометан, който е необходим, за да се осигури пълно метилиране на пробата).

Апаратчето се изважда от банята след 15 min, след което се оставя затворено 12 h при стайна температура. Апаратчето се отваря, излишъкът от диазометан реагира с прибавените няколко капки разтвор на мравчена киселина в етилацетат (4.15) и органичният разтвор се прехвърля в мерителна колба 25 сm3 (ml). Долива се до марката с хексан (4.8).

1,5 ml от този разтвор се инжектира в хроматографа.

6.4. Метилиране на стандарта.

Апаратчето и всички реактиви за получаване на диазометан се охлаждат до 0 градуса - 4 градуса С в продължение на 2 h. Във външното отделение на апаратчето се поставят:

0,2 сm3 (ml) разтвор В (6.1.1),

1 сm3 (ml) етилацетат (4.1),

0,1 сm3 (ml) метанол (4.4).

(1) Поради широката гама на типовете продукти, които могат да задържат хексахлорофен, важно е да се провери чрез тази процедура извличането на хексахлорофена от пробата, преди да се отчитат резултати. Ако извличането е лошо, трябва да се направят модификации като смяна на разтворителя (бензен вместо етилацетат) и други със съгласието на заинтересованите страни.

Метилирането продължава, както е описано в 6.3.

1 ml от получения разтвор се инжектира в хроматографа.

7. Газова хроматография

Колоната трябва да дава разделяне R, равно или по-добро от 1,5, като:

	dx(r2 - r1)
R = 2	_____________,
	W1 + W2

където:

r1 и r2 са времената на задържане в min;

W1 и W2 - широчините на пиковете при половината от височините им в mm;

dx - скоростта на хартията в mm/min.

Като подходящи са установени следните условия на хроматографиране:

Колона - неръждаема стомана.

Дължина - 1,7 m.

Диаметър - 3 mm.

Носител - Chromosorb WAW - 80 до 100 mesh.

Стационарна фаза - 10 % OV 17.

Температури:

колона - 280 градуса С,

инжектор - 280 градуса С,

детектор - 280 градуса С.

Газ-носител - азот, свободен от кислород.

Налягане - 2,3 bar.

Дебит на потока - 30 сm3 (ml)/min.

8. Изчисления

8.1. Корекционен коефициент на хексахлорофена

Изчислява се спрямо избрания стандарт във връзка със стандартната смес.

Нека:

h е хексахлорофен;

kh - неговият корекционен коефициент;

Мxh - неговата маса в сместа в g;

Axh - площта на неговия пик;

s - избраният стандарт;

Мx - неговата маса в сместа в g;

Аxs - площта на неговия пик,

тогава:

	Мxh		Axs
kh=	_____________	x	____.
	Мxs		Axh

8.2. Количество на хексахлорофена в пробата

Нека:

h е хексахлорофен;

kh - неговият корекционен коефициент;

Ah - площта на неговия пик;

s - избраният стандарт;

Ms - неговата маса в сместа в g;

As - площта на неговия пик;

М - масата на взетата проба в g,

тогава % (M/M) на хексахлорофена в пробата е:

Ms x kh x Ah x 100

___________________.

M x As

9. Повторяемост (виж ISO 5725)

За съдържание на хексахлорофен 0,1 % (M/M) разликата между две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,005 % (M/M).

ХХ. Количествено определяне на натриев тозилхлорамид (хлорамин-Т)

1. Област на приложение

Методът се отнася за количествено определяне чрез тънкослойна хроматография на натриев тозилхлорамид (хлорамин-Т) в козметични продукти.

2. Дефиниция

Съдържанието на хлорамин-Т в пробата, определено по този метод, се изразява като % (M/M).

3. Принцип

Хлорамин-Т се хидролизира напълно до 4-толуенсулфонамид чрез кипене със солна киселина.

Количеството на образувания 4-толуенсулфонамид се определя фотоденситометрично чрез тънкослойна хроматография.

4. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.

4.1. Натриев тозилхлорамид (хлорамин-Т).

4.2. Стандартен разтвор на 4-толуенсулфонамид: 0,05g 4-толуенсулфонамид в 100 сm3 (ml) етанол (4.5).

4.3. Солна киселина - 37,7 % (M/M), d420 = 1,18 g/сm3 (ml).

4.4. Диетилов етер.

4.5. Етанол, 96 % (V/V).

4.6. Подвижна фаза

4.6.1. 1-бутанол : етанол (4.5) : вода = 40 : 4 : 9 (V/V/V) или

4.6.2. хлороформ : ацетон = 6 : 4 (V/V).

4.7. Готови плаки за тънкослойна хроматография със силикагел 60, без флуоресцентен индикатор.

4.8. Калиев перманганат.

4.9. Солна киселина - 15 % (M/M).

4.10. Реактив за напръскване: 2-толуидин, 1 % (M/V) разтвор в етанол (4.5).

5. Апаратура

5.1. Стандартна лабораторна апаратура.

5.2. Стандартно оборудване за тънкослойна хроматография.

5.3. Фотоденситометър.

6. Процедура

6.1. Хидролиза

В облодънна колба 50 сm3 (ml) се претегля около 1 g от пробата (М) с точност 0,001 g. Прибавят се 5 сm3 (ml) вода и 5 сm3 (ml) солна киселина (4.3) и се кипи на обратен хладник в продължение на 1 h. Топлата суспензия веднага се прехвърля с вода в мерителна колба 50 сm3 (ml). Оставя се да се охлади и се долива до марката с вода. Центрофугира се минимум 5 min при 3000 rpm и се филтрува бистрата течност.

6.2. Екстракция

6.2.1. Вземат се 30 сm3 (ml) от филтрата и се екстрахира три пъти с по 15 сm3 (ml) диетилов етер (4.4). Ако е необходимо, етерните фази се сушат и се обединяват в мерителна колба 50 сm3 (ml). Долива се до марката с диетилов етер.

6.2.2. Вземат се 25 сm3 (ml) от изсушения етерен екстракт и се изпарява до сухо с ток от азот. Остатъкът се разтваря в 1 сm3 (ml) етанол (4.5).

6.3. Тънкослойна хроматография

6.3.1. Върху плаката за тънкослойна хроматография (4.7) се нанасят 20 ml от етанолния остатък (6.2) и същевременно 8, 12, 16 и 20 ml от стандартния разтвор на 4-толуенсулфонамид (4.2).

6.3.2. Хроматограмата се развива докато фронтът на разтворителя достигне 15 сm с подвижната фаза (4.6.1 или 4.6.2).

6.3.3. След пълно изпаряване на подвижната фаза плаката се поставя за 2 - 3 min в атмосфера на хлорни пари, които се получават чрез заливане на 2 g калиев перманганат (4.8) със 100 сm3 (ml) солна киселина (4.9) в затворен съд. Излишъкът от хлор се отстранява чрез загряване на плаката до 100 градуса С за 5 min. След това плаката се напръсква с реактив (4.10).

6.4. Измерване

След около 1 h се измерват виолетовите петна с помощта на фотоденситометър при l=525 nm.

6.5. Построяване на стандартната крива

На графика на ординатата се нанасят стойностите на максималната височина на пиковете в mm, установени за четирите петна на 4-толуенсулфонамида, на абсцисата - съответните количества на 4-толуенсулфонамида (т.е. съответно 4, 6, 8 и 10 mg на петно).

7. Забележка

Методиката може да се контролира чрез използване на 0,1 или 0,2 % (M/V) разтвори на хлорамин-Т (4.1), обработени по същия начин както пробата (6).

8. Изчисления

Съдържанието на хлорамин-Т в пробата, изразено в % (M/M), се изчислява както следва:

	1,33 x a
%(M/M) натриев тозилхлорамид =	_________,
	60 x М

където:

1,33 е фактор за превръщане на 4-толуенсулфонамид в хлорамин-Т;

а - количеството на 4-толуенсулфонамид в пробата в mg, отчетено по стандартната крива;

М - масата на взетата проба в g.

9. Повторяемост (виж ISO 5725)

За съдържание на хлорамин-Т около 0,2 % (M/M) разликата между две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,03 % (M/M).

ХХI. Определяне на общ флуор в пасти за зъби

1. Област на приложение

Методът се отнася за определяне на общ флуор в пасти за зъби, при количества на флуор не повече от 0,25 %.

2. Дефиниция

Количеството флуор в пробата, определено по този метод, се изразява в % (M/M).

3. Принцип

Определянето се извършва чрез газова хроматография. Флуорът от флуор-съдържащи съединения се превръща в кисела среда с хлортриетилсилан (TECS) в триетилфлуорсилан (TEFS) и същевременно се екстрахира с ксилен, съдържащ като вътрешен стандарт циклохексан.

4. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "за газова хроматография".

4.1. Натриев флуорид - изсушен при 120 градуса C до постоянна маса.

4.2. Вода - бидестилирана.

4.3. Солна киселина - d420 = 1,19 g/cm3 (ml).

4.4. Циклохексан (СН).

4.5. Ксилен, който не дава върху хроматограмата пикове, разположени преди пика на разтворителя, когато последният се хроматографира при същитe условия като пробата (6.1). Ако е необходимо, се пречиства чрез дестилация (5.8).

4.6. Хлортриетилсилан (TECS Merck или с еквивалентна чистота).

4.7. Стандартни разтвори на флуор.

4.7.1. Изходен стандартен разтвор - 0,250 mg F-/cm3 (ml).

Претеглят се точно 138,1 mg натриев флуорид (4.7) с точност 0,001 g и се разтварят във вода (4.2). Разтворът се прехвърля количествено в мерителна колба 250 cm3 (ml) (5.5). Долива се до марката с вода (4.2) и се разбърква.

4.7.2. Разреден стандартен разтвор 0,050 mg F-/cm3 (ml).

В мерителна колба 100 cm3 (ml) (5.5) се прехвърлят с помощта на пипета 20 cm3 (ml) от изходния разтвор (4.7.1). Долива се до марката с вода и се разбърква.

4.8. Разтвор на вътрешен стандарт:

Смесват се 1 cm3 (ml) циклохексан (4.4) и 5 cm3 (ml) ксилен (4.5).

4.9. Хлортриетилсилан - разтвор на вътрешен стандарт:

В мерителна епруветка 10 cm3 (ml) се поставят с пипета (5.7) 0,6 cm3 (ml) от TECS (4.6) и 0,12 cm3 (ml) от разтвор на вътрешен стандарт (4.8). Долива се до марката с ксилен (4.5) и се разбърква. Разтворът трябва да бъде приготвен непосредствено преди употреба.

4.10. Перхлорна киселина - 70 % (M/V).

4.11. Перхлорна киселина - 20 % (M/V).

5. Апаратура

5.1. Стандартно лабораторно оборудване.

5.2. Газов хроматограф с пламъчно-йонизационен детектор.

5.3. Хомогенизатор или подобен апарат.

5.4. Клатачна машина (Buhler) - тип SMB1 или еквивалентна.

5.5. Полипропиленови мерителни колби - 100 и 250 cm3 (ml).

5.6. Центофужни епруветки (стъклени) - 20 cm3 (ml) със запушалки на винт и тефлоново уплътнение, тип Sovirel 611-56 или еквивалентни. Епруветките и запушалките се почистват чрез потапяне в перхлорна киселина (4.11), последвано от петкратно изплакване с вода (4.2) и изсушаване при 100 градуса С.

5.7. Автоматични пипети с обхват от 50 до 200 ml с накрайници за еднократна употреба.

5.8. Апаратура за дестилация с дестилационна приставка Schneider с три кълба или еквивалентна колона Vigreux.

6. Процедура

6.1. Подготовка на пробата

6.1.1. Избира се неотваряна туба с паста за зъби, разрязва се и цялото съдържание се изстисква в пластмасов съд. Разбърква се добре и се съхранява така, че да не настъпи влошаване на качеството.

6.1.2. В центрофужна епруветка (5.6) се претеглят точно 150 mg (М) от пробата, добавят се 5 cm3 (ml) вода (4.2) и се хомогенизира (5.3).

6.1.3. Добавя се 1 cm3 (ml) ксилол (4.5).

6.1.4. Прибавят се на капки 5 cm3 (ml) солна киселина (4.3) и се хомогенизира (5.3).

6.1.5. В центрофужна епруветка (5.6) с помощта на пипета се прибавят 0,5 cm3 (ml) от разтвор (4.9), състоящ се от хлортриетилсилан и разтвор на вътрешен стандарт.

6.1.6. Епруветката се затваря с капачка на винт (5.6) и се разклаща в продължение на 45 min в клатачна машина (5.4) при 150 удара (разклащания) за min.

6.1.7. Центрофугира се за 10 min при скорост, при която се получава ясно разделяне на фазите. Епруветката се отваря, отделя се органичният слой. 3 ml от органичната фаза се инжектира в колоната на газовия хроматограф (5.2).

Забележка: Елуирането на всички компоненти продължава около 20 min.

6.1.8. Инжектирането се повтаря, изчислява се съотношението на средната площ на пиковете (ATEFS/ACH) и от стандартната крива (6.3) се отчита съответното количество флуор в mg (M1).

6.1.9. Общото съдържание на флуор в пробата се изчислява в % спрямо масата на флуора, както е отбелязано в т. 7.

6.2. Хроматографски условия

6.2.1. Колона - от неръждаема стомана

Дължина - 1,8 m

Диаметър - 3,0 mm

Носител - Gaschrom Q 80 - 100 mesh

Неподвижна фаза - силиконово масло DC 200 или еквивалентно, 20 %.

Колоната се кондиционира при 100 градуса С за около 12 h (поток на газа-носител (азот), 25 сm3/min). Процедурата се повтаря през 12 h.

След всяко четвърто или пето инжектиране колоната се рекондиционира чрез загряване до 100 градуса С за 30 min.

Температури на:

Колона - 70 градуса С

Инжектор - 150 градуса С

Детектор - 250 градуса С

Газ-носител - азот

Скорост на газа-носител - 35 cm3 (ml)/min.

6.3. Построяване на стандартна крива

6.3.1. В серия от 6 центрофужни епруветки (5.6) се поставят с пипети по 0, 1, 2, 3, 4 и 5 cm3 (ml) от разредения стандартен разтвор на флуор (4.7.2). Обемът на всяка епруветка се довежда до 5 cm3 (ml) с вода (4.2).

6.3.2. По-нататък се извършва процедура, описана от 6.1.3 до 6.1.6 включително.

6.3.3. Инжектират се по 3 ml от органичната фаза в газовия хроматограф (5.2).

6.3.4. Инжектирането се повтаря и се изчислява средното съотношение на пиковете (ATEFS/ACH).

6.3.5. Начертава се стандартната крива, корелираща с масата на флуора (mg) в стандартния разтвор (6.3.1), и съотношението на площите на пиковете (ATEFS/ACH), изчислени съгласно 6.3.4. Точките върху графиката се свързват помежду си с най-подходящата права линия, получена чрез използване на регресионен анализ.

7. Изчисления

Общото съдържание на флуор в пробата в % (M/M) F се изчислява по формулата:

	M1
%F =	_____________	x 100 %,
	M

където:

М е претеглената проба за анализ (6.1.2) в mg

М1 - количеството флуор, отчетено от стандартната крива (6.1.8) в mg.

8. Повторяемост (виж ISO 5725)

За съдържанието на флуор около 0,15 % (M/M) разликата между резултатите от две паралелно проведени определения на една и съща мостра не трябва да надвишава абсолютната стойност от 0,012 % (M/M).

ХХII. Идентификация и определяне на органоживачни съединения

Област на приложение

Методът се отнася за идентификация и определяне на органоживачни съединения, използвани като консерванти в козметични продукти за очи. Приложима е за тиомерсал (INN) (натриев 2-(етилмеркуритио)бензоат) и фенилмеркури и неговите соли.

А. Идентифициране

1. Принцип

Органоживачните съединения образуват комплекс с 1,5-дифенил-3-тиокарбазон. След екстракция на дитизоната с тетрахлорметан се провежда тънкослойна хроматография върху силикагел. Петната на дитизонатите имат оранжев цвят.

2. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ", а водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.

2.1. Сярна киселина - 25 % (V/V).

2.2. 1,5-дифенил-3-тиокарбазон (дитизон) : 0,8 mg в 100 сm3 (ml) тетрахлорметан (2.4).

2.3. Азот.

2.4. Тетрахлорметан.

2.5. Подвижна фаза : хексан : ацетон = 90 : 10 (V/V).

2.6. Стандартен разтвор - 0,001 % във вода на:

натриев 2-(етилмеркуритио) бензоат,

етилмеркурихлорид или метилмеркурихлорид,

фенилмеркуринитрат или фенилмеркуриацетат,

меркури дихлорид или меркури диацетат.

2.7. Готови плаки за тънкослойна хроматография със силикагел (напр. Merck 5721 или еквивалентни).

2.8. Натриев хлорид.

3. Апаратура

3.1. Стандартно лабораторно оборудване.

3.2. Стандартно оборудване за тънкослойна хроматография.

3.3. Филтър за разделяне на фазите.

4. Процедура

4.1. Екстракция

4.1.1. Един грам от пробата се разрежда чрез титруване с 20 сm3 (ml) дестилирана вода в центрофужна епруветка. Постига се максимално диспергиране и се загрява до 60 градуса С на водна баня. Прибавят се 4 g натриев хлорид (2.8). Разклаща се. Оставя се да се охлади.

4.1.2. Центрофугира се поне 20 min при 4500 rpm, за да се отдели по-голямата част от твърдата фаза от течността. Филтрува се в делителна фуния и се добавят 0,25 сm3 (ml) разтвор на сярна киселина (2.1).

4.1.3. Екстрахира се няколко пъти с 2 или 3 сm3 (ml) разтвор на дитизон (2.2), докато при последната екстракция органичната фаза остава зелена.

4.1.4. Последователно се филтрува всяка органична фаза през филтъра за разделяне на фазите (3.3).

4.1.5. Изпарява се до сухо с ток от азот.

4.1.6. Разтваря се с 0,5 сm3 (ml) тетрахлорметан (2.4). Този разтвор се третира веднага, както е посочено в 4.2.1.

4.2. Разделяне и идентификация

4.2.1. 50 ml от получения в 4.1.6 тетрахлорметанов разтвор се нанасят незабавно върху плаката със силикагел (2.7). Едновременно с това се обработват 10 сm3 (ml) от стандартния разтвор (2.6), както е посочено в 4.1 и върху същата плака се нанасят 50 ml от разтвора, получен в 4.1.6.

4.2.2. Плаката се поставя в подвижната фаза (2.5) и хроматограмата се развива, докато фронтът достигне 15 сm височина. Органоживачните съединения се идентифицират като оцветени петна, чийто цвят е стабилен, ако веднага след изпаряване на разтворителите слоят се покрие със стъклена пластина.

Получават се примерно следните Rf-стойности:

	Rf	Цвят
Тиомерсал	0,33	оранжев
Етилмеркурихлорид	0,29	оранжев
Метилмекурихлорид	0,29	оранжев
Фенилмеркуриеви соли	0,21	оранжев
Меркури соли	0,10	оранжев
Меркури диацетат	0,10	оранжев
1,5-дифенил-3-тиокарбазон	0,09	розов

Б. Определяне

1. Дефиниция

Съдържанието на органоживачни съединения, определено по този метод, се изразява като % (M/M) живак в пробата.

2. Принцип

Методът се състои в измерване количеството на присъстващия общ живак. Поради това е необходимо първо да се установи, че в пробата не присъства живак в неорганично състояние и да се идентифицират органоживачните производни, съдържащи се в пробата. След минерализация освободеният живак се измерва чрез безпламъкова атомно-абсорбционна спектрометрия.

3. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.).

3.1. Концентрирана азотна киселина - d420 = 1,41 g/сm3 (ml)

3.2. Концентрирана сярна киселина - d420 = 1,84 g/сm3 (ml)

3.3. Бидестилирана вода

3.4. Калиев перманганат - 7 % (M/V)

3.5. Хидроксиламин хидрохлорид - 1,5 % (M/V)

3.6. Дикалиев пероксодисулфат - 5 % (M/V)

3.7. Калаен дихлорид - 10 % (M/V)

3.8. Концентрирана солна киселина - d420 = 1,18 g/сm3 (ml)

3.9. Стъклена вата, импрегнирана с паладиев дихлорид - 1 % (M/M).

4. Апаратура

4.1. Стандартно лабораторно оборудване.

4.2. Апарат за безпламъково атомно-абсорбционно определяне на живак (техника на студените пари), включително необходимата стъклария. Оптичен път на кюветата - минимум 10 сm.

5. Процедура

Вземат се обичайните предпазни мерки за анализ на следи от живак.

5.1. Разлагане на пробата

5.1.1. Претеглят се 0,15 g от пробата (М) с точност 0,001 g. Прибавят се 10 сm3 (ml) азотна киселина (3.1) и се оставя да се разлага 3 h в херметично затворена колба на водна баня при 55 градуса С, като се разклаща често. Едновременно се разработва и празна проба на реактивите.

5.1.2. След охлаждане се прибавят 10 сm3 (ml) сярна киселина (3.2) и се връща на водната баня при 55 градуса С за 30 min.

5.1.3. Колбата се поставя в ледена баня и внимателно се прибавят 20 сm3 (ml) вода (3.3).

5.1.4. На порции се прибавят по 2 сm3 (ml) от 7 % калиев перманганат (3.4), докато разтворът остане оцветен. Връща се във водната баня при 55 градуса С за 15 min.

5.1.5. Прибавят се 4 сm3 (ml) разтвор на дикалиев пероксидисулфат (3.6). Продължава се загряването на водна баня при 55 градуса С за 30 min.

5.1.6. Оставя се да се охлади и съдържанието на колбата се прехвърля в мерителна колба 100 сm3 (ml). Колбата се промива с 5 сm3 (ml) хидроксиламинхидрохлорид (3.5) и след това се промива 4 пъти с по 10 сm3 (ml) вода (3.3). Полученият разтвор трябва да бъде напълно безцветен. Долива се до марката с вода (3.3).

5.2. Определяне

5.2.1. 10 сm3 (ml) от разтвора за изпитване (5.1.6) се поставят в стъкления съд за определяне на студени пари живак (4.2). Разрежда се със 100 сm3 (ml) вода (3.3) и последователно се прибавят 5 сm3 (ml) сярна киселина (3.2) и 5 сm3 (ml) калаен дихлорид (3.7). Разбърква се след всяко добавяне. Изчакват се 30 sec, за да се редуцират всички живачни йони до метално състояние, и се отчита резултатът (n).

5.2.2. Поставя се известно количество стъклен памук, импрегниран с паладиев дихлорид (3.9) между съда за редукция на живака и проточната кювета на инструмента (4.2). Повтаря се процедурата 5.2.1 и се записва резултатът. Ако резултатът не е нула, минерализацията е непълна и анализът трябва да се повтори.

6. Изчисления

Нека:

М е масата на пробата за изпитване в mg;

n - количеството живак, отчетено на апарата в mg.

Количеството живак, изразено като % (M/M) живак, се изчислява по формулата:

	n
% живак =	___.
	М

7. Забележки

7.1. За подобряване на минерализацията може да се започне с разреждане на пробата.

7.2. Ако се предполага абсорбция на живак от субстрата, трябва да се проведе количествено определяне по метода на стандартните добавки.

8. Повторяемост (виж ISO 5725)

За съдържание на живак около 0,007 % разликата между две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,00035 %.

ХХIII. Определяне на алкални и алкалоземни сулфиди

1. Област на приложение

Методът се отнася за определяне на сулфиди, присъстващи в козметични продукти. Присъствието на тиоли и други редуциращи агенти (вкл. сулфити) не пречи.

2. Дефиниция

Концентрацията на сулфиди, определена по този метод, се изразява в % (M/M) сяра.

3. Принцип

След подкисляване на средата сероводородът се увлича с ток от азот и се свързва под формата на кадмиев сулфид. Последният се филтрува, промива и след това се определя йодометрично.

4. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.

4.1. Концентрирана солна киселина - d420 = 1,19 g/сm3 (ml).

4.2. Натриев тиосулфат - 0,1 М стандартен разтвор.

4.3. Йод - 0,05 М стандартен разтвор.

4.4. Динатриев сулфид.

4.5. Кадмиев диацетат.

4.6. Концентриран разтвор на амоняк - d420 = 0,90 g/сm3 (ml).

4.7. Амонячен разтвор на кадмиев диацетат: разтварят се 10 g кадмиев диацетат в около 50 сm3 (ml) вода. Добавя се амоняк (4.6), докато първоначално получената утайка отново се разтвори (примерно около 20 сm3 (ml). Долива се с вода до общ обем 100 сm3 (ml).

4.8. Азот.

4.9. Амоняк - 1 М.

5. Апаратура

5.1. Стандартно лабораторно оборудване.

5.2. Облодънна тригърлена колба на шлиф 100 сm3 (ml).

5.3. Две конични колби 100 сm3 (ml) на шлиф, снабдени с приставка, съдържаща потапяща се тръба за подвеждане на газ и странична тръба за неговото отвеждане.

5.4. Фуния с дълга опашка.

6. Процедура

6.1. Увличане и фиксиране на сероводорода

6.1.1. Работи се с опаковка на продукта, която не е била отваряна преди това. В тригърлена колба (5.2) се претегля с точност 0,001 g такава маса (М) от продукта, изразена в g, която да съответства на не повече от 30 mg сулфидни йони. Прибавят се 60 сm3 (ml) вода и няколко капки пеногасител.

6.1.2. Във всяка от двете конични колби (5.3) се поставят по 50 сm3 (ml) от разтвор (4.7).

6.1.3. Към облодънната колба (5.2) се присъединяват: фуния с кран, потапяща се в течността тръба и тръба за отвеждане на газа. Отвеждащата тръба се свързва с конични колби, свързани последователно, с помощта на тръби от PVC.

Забележка: Посочената апаратура трябва да се провери за липса на утечки по следния начин: симулирайки условията на изпитването, изпитваният продукт се замества с 10 сm3 (ml) разтвор на натриев сулфид (приготвен от 4.4), който съдържа "Х" mg сулфид (определен йодометрично). Нека "Y" mg е сулфидът, определен в края на тази операция. Разликата между количество "Х" и количество "Y" не трябва да е повече от 3 %.

6.1.4. В продължение на 15 min през облодънната колба (5.2) се продухва азот (4.8) със скорост 2 мехурчета/sec, за да се измести съдържащият се в нея въздух.

6.1.5. Облодънната колба се нагрява до 85 +/- 5 градуса С.

6.1.6. Спира се подаването на азот (4.8) и през фунията се прибавят капка по капка 40 сm3 (ml) солна киселина (4.1).

6.1.7. Когато е прибавена почти всичката киселина, се пуска отново токът от азот (4.8), като във фунията се оставя минимален слой течност, за да се избегне излитане на сероводород.

6.1.8. Нагряването се прекратява след 30 min. Колбата (5.2) се оставя да се охлади, като подаването на азот продължава поне още 1 h и 30 min.

6.2. Титруване

6.2.1. Кадмиевият сулфид се филтрува през фуния с дълга опашка (5.4).

6.2.2. Коничните колби (5.3) се промиват първо с амонячен разтвор (4.9), който се излива върху филтъра. След това се промиват с дестилирана вода, която се използва за промиване на утайката върху филтъра.

6.2.3. Промиването на утайката завършва с още 100 сm3 (ml) вода.

6.2.4. Хартиеният филтър се поставя в първата конична колба, която съдържа утайката. Добавят се 25 сm3 (ml) (n1) разтвор на йод (4.3), около 20 сm3 (ml) солна киселина (4.1) и 50 сm3 (ml) дестилирана вода.

6.2.5. Определя се излишъкът на йод, като се титрува с разтвор на натриев тиосулфат (n2) (4.2).

7. Изчисления

Съдържанието на сулфиди в пробата, изразено като сяра в % (M/M), се изчислява по следната формула:

	32(n1x1 - n2x2)
% сяра =	______________,
	20М

където:

n1 е използваният стандартен разтвор на йод (4.3) в сm3 (ml);

x1 - моларността на този разтвор;

n2 - стандартен разтвор на натриев тиосулфат (4.2) в сm3 (ml);

x2 - моларността на този разтвор;

М - масата на пробата за изпитване в g.

8. Повторяемост (виж ISO 5725)

За съдържание на сулфиди около 2 % (M/M) разликата между две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,2 % (M/M).

ХХIV. Идентификация и определяне на глицерол 1-(4-аминобензоат)

А. Идентификация

1. Област на приложение

Методът се отнася за откриване на a-моноглицерил 4-аминобензоат (глицерол 1-(4-аминобензоат). Определя се и етил 4-аминобензоат (бензокаин INN), който може да присъства като онечистване.

2. Принцип

Идентификацията се извършва чрез тънкослойна хроматография на силикагел с флуоресцентен индикатор и откриване на свободна първична аминогрупа чрез образуване на диазо багрило върху плаката.

3. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.

3.1. Смес от разтворители: циклохексан : пропан-2-ол : стабилизиран дихлорметан = 48:64:9 (V/V/V).

3.2. Подвижна фаза: петролеев етер (40-60) : бензен : ацетон : разтвор на амониев хидроксид (min 25 % NH3) = 35:35:35:1 (V/V/V/V).

3.3. Реактив за проявяване:

а) натриев нитрит: 1 g в 100 cm3 (ml) 1 М солна киселина (приготвя се непосредствено преди употреба);

б) 2-нафтол: 0,2 g в 100 cm3 (ml) 1 М калиев хидроксид.

3.4. Стандартни разтвори:

- a-моноглицерил 4-аминобензоат: 0,05 g в 100 cm3 (ml) смесен разтворител 3.1;

- етил 4-аминобензоат: 0,05 g в 100 cm3 (ml) смесен разтворител (3.1).

3.5. Плаки със силикагел 60 F254 с дебелина на слоя 0,25 mm, 20 x 20 сm.

4. Апаратура

4.1. Стандартна апаратура за тънкослойна хроматография.

4.2. Ултразвукова вана.

4.3. Филтър Мillipore FH 0,5 mm или еквивалентен.

5. Процедура

5.1. Приготвяне на пробата

В мерителна колба 10 cm3 (ml) се претеглят 1,5 g с точност 0,001 g от изпитвания продукт. Долива се до марката с разтворител (3.1). Колбата се затваря и се оставя поне един час при стайна температура в ултрaзвукова вана (4.2). Филтрува се през филтър Мillipore (4.3) и филтратът се използва за хроматографиране.

5.2. Тънкослойна хроматография

Върху плаката (3.5) се нанасят по 10 ml от разтвора на пробата (5.1) и стандартните разтвори (3.4).

Хроматограмата се развива до 15 сm височина във вана, предварително наситена с подвижната фаза (3.2). Изсушава се при стайна температура.

5.3. Проявяване на петната

5.3.1. Плаката се наблюдава на УВ-светлина с дължина на вълната 254 nm.

5.3.2. Напълно изсушената плака се напръсква с реактив 3.3 (а).

Подсушава се при стайна температура за 1 min и веднага се напръсква с реактив 3.3 (б).

Плаката се изсушава в сушилня при 60 градуса С. Появяват се оранжеви петна на a-моноглицерил 4-аминобензоат с Rf - 0,07 и на етил 4-аминобензоат с Rf - 0,55.

Б. Определяне

1. Област на приложение

Методът се отнася за определяне на a-моноглицерил 4-аминобензоат. Определя се също и етил 4-аминобензоат. Не може да се определя съдържание, по-голямо от 5 % (M/M) a-моноглицерил 4-аминобензоат и 1 % (M/M) етил 4-аминобензоат.

2. Дефиниция

Съдържанието на a-моноглицерил 4-аминобензоат и етил 4-аминобензоат, определени по този метод, се изразява в % (М/M) от масата на пробата.

3. Принцип

Изпитваният продукт се суспендира в метанол и след подходяща обработка на пробата се определя чрез високоефективна течна хроматография (ВЕТХ).

4. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация за "ВЕТХ ", а водата - бидестилирана.

4.1. Метанол.

4.2. Калиев дихидрогенортофосфат (KH2PO4).

4.3. Цинков диацетат (Zn(CH3COO)2.2H2O).

4.4. Оцетна киселина (d420 = 1,05).

4.5. Тетракалиев хексацианоферат (K4(Fe(CN)6).3H2O).

4.6. Етил 4-хидроксибензоат.

4.7. a-моноглицерил 4-аминобензоат.

4.8. Етил 4-аминобензоат.

4.9. Разтвор на фосфатен буфер - 0,02 М: разтварят се 2,72 g калиев дихидрогенортофосфат (4.2) в един литър вода.

4.10. Подвижна фаза: фосфатен буфер (4.9) : метанол (4.1) = 61:39 (V/V).

Съставът на подвижната фаза може да бъде променен, така че да се постигне разделяне R і 1,5.

	dxR2 - dxR1
R = 2	____________,
	W1 + W2

където:

R1 и R2 са времената на задържане на пиковете в min;

W1 и W2 - широчините на пиковете при половината на височината им в mm;

dx - скоростта на хартията в mm/min.

4.11. Основен разтвор на a-моноглицерил 4-аминобензоат: претеглят се около 0,04 g с точност 0,001 g a-моноглицерил 4-аминобензоат и се поставят в мерителна колба 100 cm3 (ml). Разтварят се в 40 cm3 (ml) метанол (4.1). Долива се до марката с буферен разтвор (4.9) и се разбърква.

4.12. Основен разтвор на етил 4-аминобензоат: претеглят се около 0,04 g с точност 0,001 g етил 4-аминобензоат и се поставят в мерителна колба 100 cm3 (ml). Разтваря се в 40 cm3 (ml) метанол (4.1). Долива се до марката с буферен разтвор (4.9) и се разбърква.

4.13. Разтвор на вътрешен стандарт: претегля се около 0,05 g с точност 0,001 g етил 4-хидроксибензоат (4.6) и се поставя в мерителна колба 100 cm3 (ml). Разтваря се в 40 cm3 (ml) метанол (4.1). Долива се до марката с буферен разтвор (4.9) и се разбърква.

4.14. Стандартни разтвори: приготвят се четири стандартни разтвора чрез прибавяне в 100 cm3 (ml) подвижна фаза (4.10) на горните разтвори съгласно следната таблица:

Стан-	a-моноглицерил 4-	етил 4-	етил 4-
дартни	аминобензоат	аминобензоат	хидроксибензоат

разтво-	(mg/cm3	сm3(ml)	(mg/cm3	сm3(ml)	(mg/cm3	сm3(ml)
ри		(ml)*	(4.11)	(ml)*	(4.12)	(ml)*
I	8	2	8	2	50	10
II	16	4	12	3	50	10
III	24	6	16	4	50	10
IV	40	10	20	5	50	10

(*) Тези стойности са дадени за сведение и съответстват на точните маси от 4.11, 4.12 и 4.13.

Забележка: Тези разтвори могат да бъдат приготвени по различен начин.

4.15. Разтвор на Carrez I: 26,5 g тетракалиев хексацианоферат (4.5) се разтварят във вода и обемът се довежда до 250 cm3 (ml).

4.16. Разтвор на Carrez II: 54,9 g цинков диацетат (4.3) и 7,5 cm3 (ml) оцетна киселина (4.4) се разтварят във вода и обемът се довежда до 250 cm3 (ml).

4.17. Lichrosorb RP-18 на Merck или еквивалентен, със среден размер на частиците 5 mm.

5. Апаратура

5.1. Стандартно лабораторно оборудване.

5.2. ВЕТХ апарат, снабден с UV-детектор с променлива дължина на вълната, и термостат, нагласен на 45 градуса С.

5.3. Колона от неръждаема стомана: дължина - 25 сm; вътрешен диаметър - 4,6 mm; пълнеж - Lichrosorb RP-18 (4.17).

5.4. Ултразвукова вана.

6. Процедура

6.1. Приготвяне на пробата

6.1.1. Претегля се около 1,0 g от пробата с точност 0,001 g в стъклена чаша 100 cm3 (ml) и се прибавят 10 cm3 (ml) метанол (4.1).

6.1.2. Чашата се поставя в ултразвукова вана (5.4) за 20 min за получаване на суспензия. Така получената суспензия се прехвърля количествено в мерителна колба 100 cm3 (ml), използвайки не повече от 75 cm3 (ml) подвижна фаза (4.10). Последователно се прибавят 1,0 cm3 (ml) разтвор на Carrez I (4.15) и 1,0 cm3 (ml) разтвор на Carrez II (4.16), като се разбърква след всяко прибавяне. Долива се до марката с подвижна фаза (4.10), разбърква се отново и се филтрува през нагънат хартиен филтър.

6.1.3. В мерителна колба 50 cm3 (ml) се прехвърлят с пипета 3,0 cm3 (ml) от получения в 6.1.2 филтрат и 5 cm3 (ml) от разтвора на вътрешен стандарт (4.13). Долива се до марката с подвижната фаза (4.10) и се разбърква. Така полученият разтвор се използва за провеждане на хроматографския анализ съгласно т. 6.2.

6.2. Хроматографиране

6.2.1. Скоростта на потока на подвижната фаза (4.10) се нагласява на 1,2 cm3 (ml)/min, а температурата на колоната на 45 градуса С.

6.2.2. Детекторът (5.2) се настройва на 274 nm.

6.2.3. С микроспринцовка в хроматографа се дозират най-малко два пъти 20 ml от разтвора (6.1.3) и се измерват площите на пиковете.

6.3. Стандартна крива

6.3.1. Инжектират се 20 ml от всеки стандартен разтвор (4.14) и се измерват площите на пиковете.

6.3.2. За всяка концентрация се изчислява отношението между площите на пиковете на a-моноглицерил 4-аминобензоата и площите на пиковете на вътрешния стандарт. На графиката тези отношения се нанасят по абсцисата, а по ординатата се нанасят отношенията на съответните маси.

6.3.3. По същия начин се процедира и за етил 4-хидроксибензоата.

7. Изчисления

7.1. От стандартната крива, получена съгласно 6.3, се отчитат съотношенията на масите (RP1, RP2), съответстващи на отношенията между площите на пиковете, изчислени в 6.2.3,

където:

RP1 е масата на a-моноглицерил 4-аминобензоат към масата на етил 4-хидроксибензоата в g;

RP2 е масата на етил 4-аминобензоата към масата на етил 4-хидроксибензоата в g.

7.2. От получените отношения на масите се изчислява съдържанието на a-моноглицерил 4-аминобензоат и етил 4-аминобензоат, изразено в % (M/M), съгласно формулите:

	Mў
Rp % (M/M) a-моноглицерил 4-аминобензоат = RP1 x	___
	6M

	Mў
Rp % (M/M) етил 4-аминобензоат = RP2 x	___,
	6M

където:

Mў е количеството на етил 4-хидроксибензоат (вътрешен стандарт), 4.12 в g;

M - количеството на пробата, (6.1.1) в g.

8. Повторяемост (виж ISO 5725)

За съдържание на a-моноглицерил 4-аминобензоат от 5 % (M/M) разликата между резултатите от две успоредни определения, извършени на една съща проба, не трябва да превишава по абсолютна стойност 0,25 % (M/M).

За съдържание на етил 4-аминобензоат от 1 % (M/M) разликата между резултатите от две успоредни определения, извършени на една съща проба, не трябва да превишава по абсолютна стойност 0,1 % (M/M).

9. Забележки

9.1. Преди провеждане на анализите се проверява дали пробата съдържа вещества, които се застъпват с пика на вътрешния стандарт (етил 4-хидроксибензоат) на хроматограмата.

9.2. За да се провери отсъствието на всякакво застъпване, определянето се повтаря при променено относително съотношение на метанола в подвижната фаза с 10 %.

ХХV. Определяне на хлорбутанол

1. Област на приложение

Методът се отнася за определяне на хлорбутанол (INN) до максимална концентрация от 0,5 % (M/M) във всички козметични продукти, с изключение на аерозолите.

2. Дефиниция

Съдържанието на хлорбутанол, определено по този метод, се изразява в % (M/M) на пробата.

3. Принцип

След подходяща обработка на продукта, който ще се анализира, определянето се провежда с газова хроматография, като се използва 2,2,2-трихлоретанол за вътрешен стандарт.

4. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "за газова хроматография".

4.1. Хлорбутанол (1,1,1-трихлор-2-метилпропан-2-ол).

4.2. 2,2,2-трихлоретанол.

4.3. Абсолютен етанол.

4.4. Стандартен разтвор на хлорбутанол: 0,025 g в 100 cm3 (ml) етанол (4.3) (M/V).

4.5. Стандартен разтвор на 2,2,2-трихлоретанол: 4 mg в 100 cm3 (ml) етанол (4.3) (M/V).

5. Апаратура

5.1. Стандартно лабораторно оборудване.

5.2. Газхроматограф с електрон-улавящ детектор - Ni63.

6. Процедура

6.1. Приготвяне на пробата

Претеглят се между 0,1 и 0,3 g от пробата с точност 0,001 g (М). Поставят се в мерителна колба 100 cm3 (ml). Разтваря се в етанол (4.3), прибавя се 1 cm3 (ml) от разтвора на вътрешен стандарт (4.5) и се долива до марката с етанол (4.3).

6.2. Газхроматографски условия

6.2.1. Работните условия трябва да дават разделяне R і 1,5.

	dxR2 - dxR1
R = 2	____________,
	W1 + W2

където:

R1 и R2 са времената на задържане на пиковете в min;

W1 и W2 - широчини на пиковете при половината на височината им в mm;

dx - скорост на хартията в mm/min.

6.2.2. Като пример, следните работни условия дават желаното разделяне:

Колона	I	II
Материал	стъкло	неръждаема стомана
Дължина	1,80 m	3 m
Диаметър	3 mm	3 mm
Стационарна фаза	10 % Carbowax 20M	5 % OV 17 върху
	TPA върху Gaschrom	Chromosorb WAW
	Q 80 - 100 mesh	DMCS 80 - 100 mesh
Кондициониране	2 до 3 дни при 190 градуса С
Температура:
- инжектор	200 градуса С	150 градуса С
- колона	150 градуса С	100 градуса С
- детектор	200 градуса С	150 градуса С
Газ-носител	азот	аргон/метан = 95:5
		(V/V)
Скорост на потока	35 cm3 (ml)/min	35 cm3 (ml)/min

6.3. Стандартна крива

В пет мерителни колби по 100 cm3 (ml) се поставя по 1 cm3 (ml) от стандартния разтвор (4.5) и съответно 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 и 0,6 cm3 (ml) от разтвор 4.4, доливат се до марката с етанол (4.3) и се разбъркват. В хроматографа се инжектира по 1 ml от всеки от тези разтвори, съобразно работните условия, описани в 6.2.2, и се построява стандартна крива, като на абсцисата се нанася отношението на масата на хлорбутанола към масата на 2,2,2-трихлоретанола, а на ординатата - отношението между съответните площи на пиковете.

6.4. Инжектира се 1 ml от разтвора, получен в 6.1, и се процедира съгласно условията, описани в 6.2.2.

7. Изчисления

7.1. От стандартната крива (6.3) се отчита количеството "а" на хлорбутанола в разтвор 6.1, изразено в mg.

7.2. Съдържанието на хлорбутанол в пробата се изчислява съгласно формулата:

	a x 102		a
% хлорбутанол (M/M) =	____________________	=	____________________
	M x 106		M x 104

8. Повторяемост (виж ISO 5725)

За съдържание на хлорбутанол от 0,5 % (M/M) разликата между резултатите от две успоредни определения, извършени на една и съща проба, не трябва да превишава по абсолютна стойност 0,01 % (M/M).

Забележка: Ако резултатът е равен или надвишава максимално допустимата концентрация, е необходимо да се провери за отсъствие на пречещи вещества.

ХХVI. Идентификация и определяне на хинин

А. Идентификация

1. Област на приложение

Методът се отнася за откриване на хинин в шампоани и лосиони за коса.

2. Принцип

Идентификацията се извършва чрез тънкослойна хроматография върху силикагел. Хининът се доказва чрез неговата синя флуоресценция в кисела среда при 360 nm.

За допълнително потвърждение може да се използва изчезването на флуоресценцията при насищане с бромни пари. При насищане на същата плака с амонячни пари петната се появяват повторно с жълтеникава флуоресценция.

3. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.

3.1. Плаки със силикагел без флуоресцентен индикатор, дебелина на слоя 0,25 mm, 20 x 20 сm.

3.2. Подвижна фаза: толуен : диетилов етер : дихлорметан : диетиламин = 20:20:20:8 (V/V/V/V).

3.3. Метанол.

3.4. Сярна киселина - 96 % (d420 = 1,84).

3.5. Диетилов етер.

3.6. Реактив за проявяване на петната: внимателно се добавят 5 cm3 (ml) сярна киселина (3.4) към 95 cm3 (ml) диетилов етер в охладен съд.

3.7. Бром.

3.8. Разтвор на амониев хидроксид - 28 % (d420 = 0,90).

3.9. Хинин, безводен.

3.10. Стандартен разтвор: претеглят се около 0,1 g безводен хинин (3.9) с точност 0,001 g и се разтварят в мерителна колба до 100 cm3 (ml) с метанол (3.3).

4. Апаратура

4.1. Стандартно оборудване за тънкослойна хроматография.

4.2. Ултразвукова вана.

4.3. Филтър Millipore - FH 0,5 mm или еквивалентен, с подходящо оборудване за филтруване.

5. Процедура

5.1. Приготвяне на пробата

В мерителна колба 100 cm3 (ml) се претегля точно такова количество от пробата, което да съдържа около 100 mg хинин, разтваря се и се долива до марката с метанол (3.3).

Колбата се запушва и се поставя за 1 h в ултразвуковата вана (4.2) при стайна температура. Филтрува се (4.3) и филтратът се използва за хроматография.

5.2. Тънкослойна хроматография

Върху плака със силикагел (3.1) се нанасят 1,0 ml от стандартния разтвор (3.10) и 1,0 ml от разтвора на пробата (5.1). Хроматограмата се развива, докато фронтът на разтворителите достигне 15 сm, като се използва подвижна фаза (3.2) в предварително наситена вана.

5.3. Проявяване на петната

5.3.1. Плаката се изсушава на стайна температура.

5.3.2. Напръсква се с реактив 3.6.

5.3.3. Плаката се оставя да изсъхне 1 h при стайна температура.

5.3.4. Наблюдава се на УВ-светлина с дължина на вълната 360 nm. Хининът се вижда като петно с интензивна синя флуоресценция.

Като пример на таблицата по-долу са дадени Rf-стойностите в същата подвижна фаза на главните алкалоиди, свързани с хинина:

Алкалоид	Rf
Хинин	0,20
Хинидин	0,29
Цинхонин	0,33
Цинхонидин	0,27
Хидрохинидин	0,17

5.3.5. За допълнително потвърждение на присъствието на хинин плаката се насища около 1 h с бромни пари (3.7). Флуоресценцията изчезва. Когато същата плака се насити с амонячни пари (3.8), петната отново се появяват с кафяв цвят и когато плаката отново се разгледа на УВ-светлина при 360 nm, може да се наблюдава жълтеникава флуоресценция.

Откриваем минимум - 0,1 mg хинин.

Б. Определяне

1. Област на приложение

Методът се отнася за определянето на хинин. Може да бъде използван за определяне на максимално допустимата концентрация 0,5 % (M/M) в шампоани и 0,2 % в лосиони за коса.

2. Дефиниция

Съдържанието на хинин, определено по този метод, се изразява в % (M/M) на продукта.

3. Принцип

След подходяща обработка на продукта, който ще се анализира, определянето се извършва чрез високоефективна течна хроматография (ВЕТХ).

4. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "за ВЕТХ", а водата - бидестилирана.

4.1. Ацетонитрил.

4.2. Калиев дихидрогенортофосфат (KH2PO4).

4.3. Ортофосфорна киселина - 85 % (d420 = 1,7).

4.4. Тетраметиламониев бромид.

4.5. Хинин, безводен.

4.6. Метанол.

4.7. Разтвор на ортофосфорна киселина, 0,1 М: претеглят се 11,53 g ортофосфорна киселина (4.3) и се разтварят в 1000 cm3 (ml) вода в мерителна колба.

4.8. Разтвор на калиев дихидрогенортофосфат, 0,1 М: претеглят се 13,6 g калиев дихидрогенортофосфат (4.2) и се разтварят в 1000 cm3 (ml) вода в мерителна колба.

4.9. Разтвор на тетраметиламониев бромид: разтварят се 15,40 g тетраметиламониев бромид (4.4) в 1000 cm3 (ml) вода в мерителна колба.

4.10. Подвижна фаза: ортофосфорна киселина (4.7) : калиев дихидрогенортофосфат (4.8) : тетраметиламониев бромид (4.9) : вода : ацетонитрил (4.1) = 10:50:100:340:90 (V/V/V/V/V).

Съставът на подвижната фаза може да бъде променен, така че да се постигне разделяне R і 1,5.

	dxR2 - dxR1
R = 2	____________,
	W1 + W2

където:

R1 и R2 са времената на задържане на пиковете в min;

W1 и W2 - широчините на пиковете при половината на височините им в mm;

dx е скоростта на хартията в mm/min.

4.11. Силикагел, обработен с октадецилсилан, 10 mm.

4.12. Стандартни разтвори: претеглят се около 0,005; 0,01; 0,015 и 0,02 g безводен хинин (4.5) с точност 0,001g и се поставят съответно в мерителни колби 100 cm3 (ml). Долива се до марката с метанол (4.6) и съдържанието на колбите се разклаща до разтваряне на хинина. Всяка проба се филтрува през 0,5 mm филтър.

5. Апаратура

5.1. Стандартно лабораторно оборудване.

5.2. Ултразвукова вана.

5.3. Течен хроматограф с УВ детектор с променлива дължина на вълната.

5.4. Колона: дължина - 25 сm, вътрешен диаметър - 4,6 mm, пълнеж - силикагел (4.11).

5.5. Филтър Millipore - FH 0,5 mm или еквивалентен, с подходящо оборудване за филтруване.

6. Процедура

6.1. Приготвяне на пробата

В мерителна колба 100 cm3 (ml) се претегля проба с точност 0,001 g, която съдържа около 0,01 g безводен хинин. Прибавят се 20 cm3 (ml) метанол и колбата се поставя в ултразвукова вана (5.2) за 20 min. Долива се до марката с метанол (4.6). Разтворът се разбърква и след това се филтрува (5.5).

6.2. Хроматографиране

Скорост на потока - 1,0 cm3 (ml)/min.

Дължина на вълната на детектора (5.3) - 332 nm.

Обем на дозиране - 10 ml филтруван разтвор (6.1).

Измерване - площ на пика.

6.3. Стандартна крива

Най-малко три пъти се дозират 10 ml от всеки стандартен разтвор (4.12), измерва се площта на пиковете и се изчислява средната площ за всяка концентрация.

Построява се стандартната крива и се проверява нейната линейност.

7. Изчисления

7.1. От стандартната крива (6.3) се определя количеството в mg на безводен хинин, присъстващ в дозирания обем (6.2).

7.2. Концентрацията на безводен хинин в пробата, изразена като % (M/M), се получава по следната формула:

	B
%(M/M) безводен хинин =	_____________
	M

където:

В е количеството безводен хинин, определено в 10 ml филтруван разтвор(6.1) в mg;

М - масата на пробата (6.1) в g.

8. Повторяемост (виж ISO 5725)

За съдържание на безводен хинин от 0,5 % (M/M) разликата между резултатите от две успоредни определения, извършени на една и съща проба, не трябва да превишава 0,02 % (M/M).

За съдържание на безводен хинин от 0,2 % (M/M) разликата между резултатите от две успоредни определения, извършени на една и съща проба, не трябва да превишава 0,01 % (M/M).

ХХVII. Идентификация и определяне на неорганични сулфити и хидрогенсулфити

Област на приложение

Методът се отнася за идентификация и определяне на неорганични сулфити и хидрогенсулфити в козметични продукти. Той е приложим само за продукти, които имат водна или алкохолна фаза, и за концентрации до 0,2 % серен диоксид.

А. Идентификация

1. Принцип

Пробата се нагрява в солна киселина и отделеният серен диоксид се идентифицира или по неговия мирис, или по действието му върху индикаторна хартия.

2. Реактиви

Всички реактиви са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.

2.1. Солна киселина - 4 М.

2.2. Индикаторна хартия с калиев йодат и скорбяла или друга подходяща.

3. Апаратура

3.1. Стандартно лабораторно оборудване.

3.2. Колба 25 cm3 (ml), снабдена с къс обратен хладник.

4. Процедура

4.1. Около 2,5 g от пробата се поставят в колба (3.2) с 10 cm3 (ml) солна киселина (2.1).

4.2. Разбърква се и се нагрява до кипене.

4.3. Изпитва се за отделяне на серен диоксид или по миризмата, или с индикаторна хартия (2.2).

Б. Определяне

1. Дефиниция

Съдържанието на сулфити или хидрогенсулфити в пробата, определени по този метод, се изразява в % (М/М) като серен диоксид.

2. Принцип

Отделеният серен диоксид след подкисляване на пробата се дестилира в разтвор на водороден пероксид. Образуваната сярна киселина се титрува със стандартен разтвор на натриев хидроксид.

3. Реактиви

Всички реактиви са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.

3.1. Водороден пероксид - 0,2 % (M/V). Приготвя се непосредствено преди анализа.

3.2. Ортофосфорна киселина (d425 = 1,75).

3.3. Метанол.

3.4. Натриев хидроксид - 0,01 М стандартен разтвор.

3.5. Азот.

3.6. Индикатор: смес 1:1 (V/V) от метилово червено, 0,03 % (M/V) в етанол и метиленово синьо, 0,05 % (M/V) в етанол. Разтворът се филтрува.

4. Апаратура

4.1. Стандартно лабораторно оборудване.

4.2. Дестилационна апаратура (виж фигурата).

5. Процедура

5.1. Претегля се около 2,5 g от пробата с точност 0,001g в дестилационната колба А (виж фигурата).

5.2. Прибавят се 60 cm3 (ml) вода и 50 cm3 (ml) метанол (3.3) и се разбърква.

5.3. В дестилационния приемник D (виж фигурата) се поставят 10 cm3 (ml) водороден пероксид (3.1), 60 cm3 (ml) вода и няколко капки индикатор (3.6). Прибавят се няколко капки натриев хидроксид (3.4), докато индикаторът промени цвета си в зелен.

5.4. За промивния съд Е (виж фигурата) се повтаря процедура 5.3.

5.5. Апаратурата се сглобява и се нагласява потокът от азот (3.5) на около 60 мехурчета в min.

5.6. Посредством фунията в дестилационната колба А се прибавят 15 cm3 (ml) ортофосфорна киселина (3.2).

5.7. Нагрява се бързо до кипене и след това се поддържа слабо кипене за общо 30 min.

5.8. Отделя се дестилационният приемник D. Тръбата се промива и след това се титрува с разтвор на натриев хидроксид (3.4) до промяна на индикатора (3.6) в зелено.

6. Изчисления

Съдържанието на сулфит или хидрогенсулфит се изчислява като % (М/М) в пробата чрез израза:

	3,2МxV
%(M/M) серен диоксид =	_______,
	М

където:

Мx е моларната концентрация на разтвора на натриевия хидроксид (3.4);

V - обемът на натриевия хидроксид (3.4), използван при титруването (5.8), в cm3 (ml);

М - масата на пробата (5.1) в g.

7. Повторяемост (виж ISO 5725)

За съдържание на серен диоксид от 0,2 % (M/M) разликата между резултатите от две успоредни определения, извършени на една и съща проба, не трябва да превишава 0,006 %.

Апарат за дестилация на серен диоксид по Tanner

Всички размери са в mm

ХХVIII. Идентификация и определяне на хлорати на алкални метали

Област на приложение

Методът се отнася за идентификация и определяне на хлорати в пасти за зъби и други козметични продукти.

А. Идентификация

1. Принцип

Хлоратите се отделят от другите халогенати чрез тънкослойна хроматография и се идентифицират чрез окисление на йодид до йод.

2. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.

2.1. Стандартни разтвори: водни разтвори на калиев хлорат, бромат и йодат, 0,2 % (M/V), приготвени непосредствено преди употреба.

2.2. Подвижна фаза: разтвор на амоняк, 28 % (M/V) : ацетон : бутанол = 60:130:30 (V/V/V).

2.3. Калиев йодид, воден разтвор - 5 % (M/V).

2.4. Разтвор на скорбяла - 1 до 5 % (M/V).

2.5. Солна киселина - 1 М.

2.6. Готови плаки за тънкослойна хроматография със слой целулоза 0,25 mm.

3. Апаратура

Стандартно оборудване за тънкослойна хроматография.

4. Процедура

4.1. Около 1 g от пробата се екстрахира с вода, филтрува се и се разрежда до около 25 cm3 (ml).

4.2. Върху плаката (2.6) се нанасят 2 ml от разтвор (4.1) и по 2 ml от стандартните разтвори (2.1).

4.3. Плаката се поставя в хроматографската вана и се развива възходящо до 3/4 от височината на плаката (2.6) с подвижната фаза 2.2.

4.4. Плаката се изважда от ваната и се оставя да се изпари разтворителят. (Забележка: това може да отнеме до 2 h.)

4.5. Плаката се напръсква с калиев йодид (2.3) и се оставя да се изсуши за около 5 min.

4.6. Плаката се напръсква с разтвор на скорбяла (2.4) и се оставя да се изсуши за около 5 min.

4.7. Плаката се напръсква със солна киселина (2.5).

5. Оценка на хроматограмата

Ако присъства хлорат, се наблюдава синьо петно (възможно е петното да бъде кафяво), което се появява след 30 min с Rf стойност приблизително 0,7 - 0,8.

Халогенати	Rf
Йодат	0 до 0,2
Бромат	0,5 до 0,6
Хлорат	0,7 до 0,8

Трябва да се отбележи, че броматите и йодатите реагират веднага.

Да се внимава да не се объркат петната на броматите и хлоратите!

Б. Определяне

1. Дефиниция

Съдържанието на хлорат, определено по този метод, се изразява като % (M/M) хлорат.

2. Принцип

Хлоратът се редуцира с цинков прах в кисела среда. Образуваният хлорид се измерва чрез потенциометрично титруване с разтвор на сребърен нитрат. Такова определяне, извършено преди редукцията, дава възможност да се установи възможно присъствие на халогениди.

3. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.

3.1. Оцетна киселина, 80 % (M/M).

3.2. Цинков прах.

3.3. Стандартен разтвор 0,1 М.

4. Апаратура

4.1. Стандартно лабораторно оборудване.

4.2. Потенциометър, снабден със сребърен индикаторен електрод.

5. Процедура

5.1. Приготвяне на пробата

Претегля се около 2 g от пробата с точност 0,001 g (M) в центрофужна епруветка. Прибавят се около 15 cm3 (ml) оцетна киселина (3.1) и внимателно се разбърква. Изчакват се 30 min и се центрофугира 15 min при 2000 rpm. Бистрият филтрат се прехвърля в мерителна колба 50 cm3 (ml). Центрофугирането се повтаря още два пъти, като към остатъка се прибавят по 15 cm3 (ml) оцетна киселина (3.1). Разтворите, съдържащи хлората, се събират в същата мерителна колба. Долива се до марката с оцетна киселина (3.1).

5.2. Редуциране на хлоратите

Вземат се 20 cm3 (ml) от разтвор 5 1 и се прибавя 0,6 g цинков прах (3.2). Сместа се довежда до кипене в колба, снабдена с обратен хладник. Кипи се в продължение на 30 min, охлажда се и се филтрува. Колбата се изплаква с вода. Промивните води след филтруване се прибавят към първия филтрат.

5.3. Определяне на хлориди

20 cm3 (ml) от разтвор 5.2 се титрува със сребърен нитрат (3.3), като се използва потенциометър (4.2). По същия начин се титруват 20 cm3 (ml) от разтвор 5.1 със сребърен нитрат (3.3).

Забележка: Ако продуктът съдържа бромни или йодни производни, които могат да дадат бромиди и йодиди при редукцията, кривата на титруване ще има няколко инфлексни точки. В такъв случай обемът на титруващия разтвор (3.3), съответстващ на хлоридите, се получава като разлика между предпоследната и последната инфлексна точка.

6. Изчисления

Съдържанието на хлорати в пробата % (M/M) се изчислява по формулата:

	20,9(V - Vx)Mx
Хлорат (ClО3 - ) %M/M =	__________________,
	M

където:

V е обемът на разтвора на сребърен нитрат (3.3), използван за титруване на разтвор 5.2, в cm3 (ml);

Vx - обемът на разтвора на сребърен нитрат (3.3), използван за титруване на разтвор 5.1, в cm3 (ml);

Mx - моларността на стандартния разтвор на сребърен нитрат (3.3);

M - масата на пробата в g.

7. Повторяемост (виж ISO 5725)

За съдържание на хлорат от 3 до 5 % разликата между резултатите от две успоредни определения, извършени на една и съща проба, не трябва да превишава 0,07 % (M/M).

ХХIХ. Идентификация и определяне на натриев йодат

Област на приложение

Методът се отнася за идентификация и определяне на натриев йодат в козметични продукти.

А. Идентификация

1. Принцип

Натриевият йодат се отделя от другите халогенати чрез тънкослойна хроматография и се идентифицира чрез окисление на йодид до йод.

2. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.

2.1. Стандартни разтвори: водни разтвори на калиев хлорат, бромат и йодат, 0,2 % (M/V), приготвени непосредствено преди употреба.

2.2. Подвижна фаза: разтвор на амоняк, 28 % (M/V) : ацетон : бутанол = 60:130:30 (V/V/V).

2.3. Калиев йодид - 5 % (M/V).

2.4. Разтвор на скорбяла - 1 до 5 % (M/V).

2.5. Солна киселина - 1 М.

3. Апаратура

3.1. Готови плаки за тънкослойна хроматография със слой целулоза 0,25 mm.

3.2. Стандартно оборудване за тънкослойна хроматография.

4. Процедура

4.1. Около 1 g от пробата се екстрахира с вода, филтрува се и се разрежда до около 10 cm3 (ml).

4.2. На стартовата линия върху плаката се нанасят 2 ml от този разтвор и по 2 ml от всеки от трите стандартни разтвора (2.1).

4.3. Плаката се поставя в хроматографската вана и се развива възходящо до 3/4 от височината на плаката с подвижната фаза (2.2).

4.4. Плаката се изважда от ваната и се оставя да се изпари разтворителят при стайна температура. (Забележка: това може да отнеме до 2 h.)

4.5. Плаката се напръсква с калиев йодид (2.3) и се оставя да се изсуши за около 5 min.

4.6. Плаката се напръсква с разтвор на скорбяла (2.4) и се оставя да изсъхне за около 5 min.

4.7. Накрая се напръсква със солна киселина (2.5).

5. Оценка на хроматограмата

При наличие на йодат се наблюдава синьо петно (цветът може да бъде кафяв или да стане кафяв при престояване) с Rf стойност приблизително от 0 до 0,2.

Трябва да се отбележи, че броматите дават веднага положителна реакция при Rf приблизително от 0,5 до 0,6, а хлоратите - след около 30 min при Rf от 0,7 до 0,8.

Б. Определяне

1. Дефиниция

Съдържанието на натриев йодат, определено по този метод, се изразява като % (M/M) натриев йодат.

2. Принцип

Натриевият йодат се разтваря във вода и се определя чрез високоефективна течна хроматография с използване на последователно свързани колони с С18 обърната фаза и анионобменна колона.

3. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "за ВЕТХ", а водата - бидестилирана.

3.1. Солна киселина - 4 М.

3.2. Натриев сулфит - 5 % (M/V).

3.3. Основен разтвор на натриев йодат.

Приготвя се основен разтвор, който съдържа 50 mg натриев йодат в 100 cm3 (ml) вода.

3.4. Калиев дихидрогенортофосфат.

3.5. Динатриев хидрогенортофосфат 2Н2О.

3.6. Подвижна фаза за ВЕТХ: разтварят се 3,88 g калиев дихидрогенортофосфат (3.4) и 1,19 g динатриев хидрогенортофосфат. 2Н2О (3.5) в 1dm3 (l) вода. рН на получения разтвор трябва да бъде 6,2.

3.7. Хартиен универсален индикатор, рН 1-11.

4. Апаратура

4.1. Стандартно лабораторно оборудване.

4.2. Кръгове филтърна хартия с диаметър 11 сm, Schleicher and Schull № 575 или еквивалентна.

4.3. Високоефективен течен хроматограф с детектор с променлива дължина на вълната.

4.4. Колони: дължина - 12 сm, вътрешен диаметър - 4,6 mm, брой - две, свързани последователно; първа колона - NucleosilR 5 C18 или еквивалентна; втора колона - VydacTM 301-SB или еквивалентна.

5. Процедура

5.1. Приготвяне на пробата

5.1.1. Течни проби (шампоани)

Претегля се около 1 g от пробата за изпитване с точност 0,001 g в стъклена градуирана епруветка със запушалка или в мерителна колба 10 cm3 (ml). Долива се до марката с вода и се разбърква. Ако е необходимо, разтворът се филтрува.

Определя се съдържанието на йодат в разтвора чрез ВЕТХ по начина, описан в 5.2.

5.1.2. Твърди проби (сапуни)

Внимателно се отделя част от пробата и се претегля около 1,0 g с точност 0,001 g в стъклен мерителен цилиндър от 100 cm3 (ml) със запушалка. Напълва се до 50 cm3 (ml) с вода и енергично се разбърква в продължение на една минута. Центрофугира се и се филтрува през филтърна хартия (4.2) или сместа се оставя да престои една нощ.

Желеобразният разтвор се разклаща енергично и се филтрува през филтърна хартия (4.2).

Определя се съдържанието на йодат в разтвора чрез ВЕТХ по начина, описан в 5.2.

5.2. Хроматография

- Скорост на потока - 1 cm3 (ml)/min.

- Дължина на вълната на детектора (4.3) - 210 nm.

- Обем за дозиране - 10 ml.

- Измерване - площ на пика.

5.3. Стандартна крива

В мерителни колби 50 cm3 (ml) се поставят с пипета съответно 1,0; 2,0; 5,0; 10,0 и 20,0 cm3 (ml) от основния разтвор на натриев йодат (3.3). Доливат се до марката и се разбъркват. Така получените разтвори съдържат съответно 0,01; 0,02; 0,05; 0,10 и 0,20 mg/cm3 (ml) натриев йодат.

В течния хроматограф (4.3) се дозират по 10 ml от всеки стандартен разтвор на йодат и се получава хроматограма. Определя се площта на пика на йодата и се построява стандартна крива от площите на пиковете спрямо концентрациите на натриевия йодат.

6. Изчисления

Съдържанието на натриев йодат в % (M/M) се изчислява по формулата:

	V x c
% (M/M) натриев йодат =	_____,
	10M

където:

М е масата на пробата в g;

V - общият обем на пробата, получен съгласно 5.2, в cm3 (ml);

с - концентрацията на натриевия йодат, отчетена от стандартната крива (5.3), в mg/cm3 (ml).

7. Повторяемост (виж ISO 5725)

За съдържание на натриев йодат от 0,1 % (M/M) разликата между резултатите от две успоредни определения, извършени на една и съща проба, не трябва да превишава 0,002 %.

8. Потвърждаване

8.1. Принцип

В подкислен разтвор на козметичния продукт йодатът (IO3 - ) се редуцира до йодид (I - ) със сулфит и полученият разтвор се изследва с ВЕТХ. Ако пикът, който има време на задържане, отговарящо на времето на задържане на йодата, изчезне след третиране със сулфит, то твърде вероятно е оригиналният пик да се дължи на йодат.

8.2. Процедура

От разтвора на пробата, получен както е описано в 5.1, се вземат с пипета 5 cm3 (ml) и се поставят в конична колба.

рН на разтвора се довежда до стойност 3 или по-ниска със солна киселина (3.1); използва се хартиен универсален индикатор (3.7).

Прибавят се 3 капки разтвор на натриев сулфит (3.2) и се разбърква.

Дозират се 10 ml от получения разтвор в течния хроматограф (4.3).

Сравнява се тази хроматограма с хроматограмата, получена както е описано в т. 5 за същата проба.

ХХХ. Идентификация и определяне на сребърен нитрат в козметични продукти

А. Идентификация

1. Област на приложение

Методът се отнася за идентификацията на сребърен нитрат като сребро във водни козметични продукти.

2. Принцип

Среброто се идентифицира като характерна бяла утайка, образувана с хлорни йони.

3. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.

3.1. Солна киселина - 2 М.

3.2. Амоняк: концентриран разтвор на амониев хидроксид (d20 = 0,88 g/сm3 (ml) се разрежда с равен обем вода и се разбърква.

3.3. Азотна киселина - 2 М.

4. Апаратура

4.1. Стандартно лабораторно оборудване.

4.2. Центрофуга.

5. Процедура

5.1. Към около 1 g от пробата в центрофужна епруветка се добавя на капки 2 М разтвор на солна киселина (3.1) до пълно утаяване; разбърква се и се центрофугира.

5.2. Отстранява се бистрият разтвор и утайката се промива еднократно с пет капки студена вода. Промивната вода се изхвърля.

5.3. В центрофужната епруветка се добавя количество вода, равно на обема на утайката. Нагрява се до кипене при разбъркване.

5.4. Горещата смес се центрофугира; отстранява се бистрият разтвор.

5.5. Към утайката се прибавят няколко капки амонячен разтвор (3.2); разбърква се и се центрофугира.

5.6. Една капка от бистрия разтвор се поставя върху стъклена плочка и към нея се прибавят няколко капки азотна киселина (3.3).

5.7. Бяла утайка показва наличието на сребро.

Б. Определяне

1. Област на приложение

Този метод се отнася за определяне на сребърен нитрат като сребро в козметични продукти, предназначени за оцветяване на мигли и вежди.

2. Принцип

Среброто в продукта се определя чрез атомно-абсорбционна спектрометрия.

3. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - бидестилирана.

3.1. Азотна киселина - 0,02 М.

3.2. Стандартни разтвори на сребро.

3.2.1. Основен стандартен разтвор на сребро - 1000 mg/cm3 (ml) в 0,5 М разтвор на азотна киселина (Spectrosol или еквивалентен).

3.2.2. Работен стандартен разтвор на сребро - 100 mg/cm3 (ml); с пипета се прехвърлят 10 cm3 (ml) от основния стандартен разтвор на сребро (3.2.1) в мерителна колба от 100 cm3 (ml). Долива се до марката с 0,02 М разтвор на азотна киселина (3.1) и се разбърква. Този стандартен разтвор трябва да е приготвен непосредствено преди употреба и да се съхранява в бутилка от тъмно стъкло.

4. Апаратура

4.1. Стандартно лабораторно оборудване.

4.2. Атомно-абсорбционен спектрометър със сребърна лампа (кухокатодна).

5. Процедура

5.1. Приготвяне на пробата

Претегля се около 0,1 g (М) с точност 0,001 g от хомогенна проба на продукта. Прехвърля се количествено в мерителна колба от 1 dm3 (l) и се долива до марката с 0,02 М разтвор на азотна киселина (3.1) и се разбърква.

5.2. Условия за атомно-абсорбционна спектрометрия

Пламък - въздух - ацетилен

Дължина на вълната - 338,3 nm

Процеп - 0,7 nm

Корекция на фона - не

Условия на горене - окислителен пламък; за максимална абсорбция е необходимо оптимизиране на височината на горелката и подаването на газовата смес.

5.3. Стандартна крива

5.3.1. В мерителни колби 100 cm3 (ml) се поставят с пипета 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 и 5,0 cm3 (ml) от работния стандартен разтвор на сребро (3.2.2). Всяка колба се долива до марката с 0,02 М разтвор на азотна киселина (3.1) и се разбърква. Тези разтвори съдържат съответно 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 и 5,0 mg/cm3 (ml) сребро.

5.3.2. Измерва се абсорбцията на 0,02 М разтвор на азотна киселина (3.1) и тази стойност се използва като нулева концентрация на сребро за стандартната крива. Измерва се абсорбцията на всеки стандартен разтвор на сребро (5.3.1). Построява се стандартна крива, като се нанасят стойностите на абсорбцията спрямо концентрацията на сребро.

5.4. Определяне.

Измерва се абсорбцията на пробата (5.1). От стандартната крива се отчита концентрацията на сребро, съответстваща на абсорбцията, получена за разтвора на пробата.

6. Изчисления

Съдържанието на сребърен нитрат в пробата се изчислява в % (М/М) по формулата:

	1,5748 x c
% (M/M) сребърен нитрат =	__________,
	10 x М

където:

M е масата на пробата, взета за анализ (5.1), в g;

с - концентрацията на сребро в разтвора на пробата (5.1), отчетена от стандартната крива, в mg/cm3 (ml).

8. Повторяемост (виж ISO 5725)

За съдържание на сребърен нитрат 4 % (М/М) разликата между резултатите от две успоредни определения, извършени на една и съща проба, не трябва да надвишава 0,05 % (М/М).

ХХХI. Идентификация и определяне на селенов дисулфид в противопърхотни шампоани

А. Идентификация

1. Област на приложение

Методът се отнася за идентифицикацията на селенов дисулфид като селен в противопърхотни шампоани.

2. Принцип

Селенът се идентифицира като характерно жълто оцветяване, което се получава при реакция с карбамид и калиев йодид.

3. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.

3.1. Азотна киселина - концентрирана (d20 = 1,42 g/cm3 (ml).

3.2. Карбамид.

3.3. Калиев йодид - 10 % (М/V): разтварят се 10 g калиев йодид в 100 cm3 (ml) вода.

4. Апаратура

4.1. Стандартно лабораторно оборудване.

4.2. Епруветка за разлагане с обем 100 cm3 (ml).

4.3. Нагревателен блок за разлагане.

4.4. Филтърна хартия (Whatman № 42 или еквивалентна) или мембранен филтър 0,45 mm.

5. Процедура

5.1. Към около 1 g от шампоана, поставен в епруветка (4.2) се прибавят 2,5 cm3 (ml) концентрирана азотна киселина (3.1) и се разлагат в блока (4.3) при температура 150 градуса С в продължение на 30 min.

5.2. Разложената проба се разрежда до 25 cm3 (ml) с вода и се филтрува през филтърна хартия или мембранен филтър (4.4).

5.3. Към 2,5 cm3 (ml) от филтрата се прибавя 1 cm3 (ml) вода, 2,5 g карбамид и се кипи. Охлажда се и се прибавя 1 cm3 (ml) разтвор на калиев йодид (3.3).

5.4. Жълто до оранжево оцветяване, което бързо потъмнява при престояване, показва наличието на селен.

Б. Определяне

1. Област на приложение

Този метод е подходящ за определяне на селенов дисулфид като селен в противопърхотни шампоани, съдържащи до 4,5 % (М/М) селенов дисулфид.

2. Принцип

Пробата се разлага с азотна киселина и селенът се определя чрез атомно-абсорбционна спектрометрия.

3. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - бидестилирана.

3.1. Азотна киселина - концентрирана (d20 = 1,42 g/cm3 (ml).

3.2. Азотна киселина - 5 % (V/V): 50 cm3 (ml) концентрирана азотна киселина се прибавят към 500 cm3 (ml) вода в стъклена чаша при непрекъснато разбъркване. Този разтвор се прехвърля в мерителна колба от 1 dm3 (l) и се долива до марката с вода.

3.3. Основен стандартен разтвор на селен - 1000 mg/cm3 (ml) в 0,5 М азотна киселина (Spectrosol или еквивалентна).

4. Апаратура

4.1. Стандартно лабораторно оборудване.

4.2. Епруветка за разлагане с обем 100 cm3 (ml).

4.3. Нагревателен блок за разлагане.

4.4. Филтърна хартия (Whatman № 42 или еквивалентна) или мембранен филтър 0,45 mm.

4.5. Атомно-абсорбционен спектрометър със селенова лампа (безелектродна).

5. Процедура

5.1. Приготвяне на пробата

5.1.1. Претегля се около 0,2 g (M) с точност 0,001 g от хомогенна проба на продукта в епруветката (4.2).

5.1.2. Прибавят се 5 cm3 (ml) концентрирана азотна киселина (3.1) и се разлага в блока (4.3) при температура 150 градуса С в продължение на 1 h.

5.1.3. Разтворът се оставя да се охлади и се прибавят 100 cm3 (ml) вода. Филтрува се през филтърна хартия или през мембранен филтър 0,45 mm (4.4) и филтрираният разтвор се запазва за определянето.

5.2. Условия за атомно-абсорбционна спектрометрия

Пламък - въздух - ацетилен

Дължина на вълната - 196,0 nm

Процеп - 0,7 nm

Корекция на фона - да

Условия на горене - окислителен пламък; за максимална абсорбция е необходимо оптимизиране на височината на горелката и газовата смес.

5.3. Стандартна крива

5.3.1. В мерителни колби 100 cm3 (ml) се поставят с пипета 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 и 5,0 cm3 (ml) от основния стандартен разтвор на селен (3.3). Всяка колба се долива до марката с 5 % (V/V) разтвор на азотна киселина (3.2) и се разбърква. Тези разтвори съдържат съответно 10; 20; 30; 40 и 50 mg/cm3 (ml) селен.

5.3.2. Измерва се абсорбцията на 5 % (V/V) разтвор на азотна киселина (3.2) и тази стойност се използва като нулева концентрация на селен за стандартната крива. Измерва се абсорбцията на всеки стандартен разтвор на селен (5.3.1). Построява се стандартна крива, като се нанасят стойностите на абсорбцията спрямо концентрацията на селен.

5.4. Определяне.

Измерва се абсорбцията на пробата (5.1.3). От стандартната крива се отчита концентрацията на селен, съответстваща на абсорбцията, получена за разтвора на пробата.

6. Изчисления

Съдържанието на селенов дисулфид в пробата се изчислява в % (М/М) по формулата:

	1,812 x c
% (M/M) селенов дисулфид =	__________,
	100 x М

където:

М е масата на пробата, взета за анализ (5.1.1), в g;

с - концентрацията на селен в разтвора на пробата (5.1.3), отчетена от стандартната крива, в mg/cm3 (ml).

8. Повторяемост (виж ISO 5725)

За съдържание на селенов дисулфид 1 % (M/M) разликата между резултатите от две успоредни определения, извършени на една и съща проба, не трябва да надвишава 0,05 % (M/M).

ХХХII. Определяне на разтворими барий и стронций в твърди и течни пигменти

А. Определяне на разтворим барий

1. Област на приложение

Методът се отнася за извличане и определяне на разтворим барий от твърди и течни пигменти.

2. Принцип

Пигментът се екстрахира с 0,07 М разтвор на солна киселина при определени условия и количеството на бария в екстракта се определя чрез атомно-абсорбционна спектрометрия.

3. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - бидестилирана.

3.1. Етанол, абсолютен.

3.2. Солна киселина - 0,07 М.

3.3. Солна киселина - 0,5 М.

3.4. Калиев хлорид - 8 % (М/V): 16 g калиев хлорид се разтварят в 200 cm3 (ml) 0,07 М солна киселина (3.2).

3.5. Стандартни разтвори на барий

3.5.1. Основен стандартен разтвор на барий - 1000 mg/cm3 (ml) в 0,5 М азотна киселина (Spectrosol или равностоен).

3.5.2. Работен стандартен разтвор на барий, 200 mg/cm3 (ml): в мерителна колба от 100 cm3 (ml) се прехвърлят с пипета 20,0 cm3 (ml) от основния стандартен разтвор на барий (3.5.1). Долива се до марката с 0,07 М разтвор на солна киселина (3.2) и се разбърква.

4. Апаратура

4.1. Стандартно лабораторно оборудване.

4.2. рН-метър с точност +/- 0,02 единици.

4.3. Клатачна машина за колби.

4.4. Мембранен филтър с големина на порите 0,45 mm.

4.5. Атомно-абсорбционен спектрометър с бариева лампа (кухокатодна).

5. Процедура

5.1. Приготвяне на пробата

5.1.1. Претегля се около 0,5 g (М) с точност 0,001 g от пигмента в конична колба. За да се осигури достатъчен обем за ефективно разбъркване, не трябва да се използва колба с обем, по-малък от 150 cm3 (ml).

5.1.2. С пипета се прибавя 1,0 cm3 (ml) етанол (3.1) и колбата се разклаща с кръгови движения така, че да се получи пълно омокряне на пигмента. С бюрета се прибавя такова точно количество 0,07 М солна киселина, че да се получи съотношение между обема на киселината и масата на пигмента точно 50 cm3 (ml)/g. Общият обем на сместа, вкл. етанолът, е V cm3 (ml). Съдържанието на колбата се разклаща 5 sec, за да се осигури пълно смесване на компонентите.

5.1.3. Измерва се рН на получената суспензия с помощта на рН-метър (4.2) и ако е над 1,5, се прибавя на капки 0,5 М солна киселина (3.3) до рН в интервала 1,4 до 1,5.

5.1.4. Колбата се запушва и незабавно се поставя на клатачна машина (4.3) за разклащане в продължение 60 min. Клатачната машина трябва да работи с достатъчна скорост, така че да се образува пяна. Филтрува се през мембранен филтър с размер на порите 0,45 mm (4.4) и филтратът се събира. Екстрактът преди филтруването не се центрофугира. С пипета се прехвърлят 5 cm3 (ml) от филтрата в мерителна колба от 50 cm3 (ml);

обемът се довежда до марката с 0,07 М солна киселина (3.2) и се разбърква. Този разтвор се използва и за определянето на стронций (част Б).

5.1.5. С пипета се прехвърлят 5,0 cm3 (ml) разтвор на калиев хлорид (3.4) в мерителна колба 100 cm3 (ml) и аликвотно количество (WBa cm3 (ml) от разредения филтрат (5.1.4), така че да се получи предполагаема концентрация на барий между 3 и 10 mg/cm3 (ml) (аликвотна част от 10 cm3 (ml) е добра отправна точка). Долива се до марката с 0,07 М солна киселина (3.2) и се разбърква.

5.1.6. Концентрацията на барий в разтвора (5.1.5) се определя чрез атомно-абсорбционна спектрометрия в деня на анализа.

5.2. Условия за атомно-абсорбционна спектрометрия

Пламък - азотен оксид/ацетилен

Дължина на вълната - 553,5 nm

Процеп - 0,2 nm

Корекция на фона - не

Условия на горене - редукционен пламък; за максимална абсорбция е необходимо оптимизиране на височината на горелката и газовата смес.

5.3. Стандартна крива

5.3.1. В мерителни колби 100 cm3 (ml) се поставят с пипета 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 и 5,0 cm3 (ml) от работния стандартен разтвор на барий (3.5.2). Във всяка колба с пипета се прибавят 5,0 cm3 (ml) разтвор на калиев хлорид (3.4), обемът се долива до марката с 0,07 М солна киселина (3.2) и се разбърква. Тези разтвори съдържат съответно 2,0; 4,0; 6,0; 8,0 и 10,0 mg/cm3 (ml) барий.

По същия начин се приготвя празна проба, без да се използва стандартен разтвор на барий.

5.3.2. Измерва се абсорбцията на празната проба (5.3.1) и получената стойност се използва като нулева концентрация на барий за стандартната крива. Измерва се абсорбцията на всеки стандартен разтвор на барий (5.3.1). Построява се стандартна крива, като се нанасят стойностите на абсорбцията спрямо концентрацията на барий.

5.4. Определяне.

Измерва се абсорбцията на пробата (5.1.5). От стандартната крива се отчита концентрацията на барий, съответстваща на абсорбцията, получена за разтвора на пробата.

6. Изчисления

Съдържанието на разтворим барий в пигмента се изчислява в % (M/M) по формулата:

	c x V
% (M/M) разтворим барий =	_____________,
	10 x WBa x M

където:

М е масата на пробата, взета за анализ (5.1.1), в g;

с - концентрацията на барий в разтвора на пробата (5.1.5), отчетена от стандартната крива, в mg/cm3 (ml);

V - общият обем на извлека (5.1.2) в cm3 (ml);

WBa - обемът на екстракта, (взет в 5.1.5) в cm3 (ml).

7. Повторяемост (виж ISO 5725).

Най-добрата възможна повторяемост за този метод е 0,3 % при съдържание на разтворим барий 2 % (M/M).

8. Забележки

8.1. При определени условия абсорбцията на бария може да бъде завишена от присъствието на калций. Това може да бъде предотвратено чрез прибавяне на магнезиев йон с концентрация 5 g/dm3 (l) ("Magnesium as modifier for the determination of barium by flame atomic emission spectrometry". Jerrow, M. et al., Analytical Proceedings, 1991, 28, 40.).

8.2. Като алтернативен метод на пламъковата атомно-абсорбционна спектрометрия се допуска атомно-емисионна спектрометрия с индуктивно свързана плазма (ICP-AES).

Б. Определяне на разтворим стронций

1. Област на приложение

Този метод описва процедура за извличане и определяне на разтворим стронций от твърди и течни пигменти.

2. Принцип

Пигментът се екстрахира с 0,07 М разтвор на солна киселина при определени условия и количеството на стронция в екстракта се определя чрез атомно-абсорбционна спектрометрия.

3. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - бидестилирана.

3.1. Етанол - абсолютен.

3.2. Солна киселина - 0,07 М.

3.3. Калиев хлорид - 8 % (М/V): 16 g калиев хлорид се разтварят в 200 cm3 (ml) 0,07 М разтвор на солна киселина (3.2).

3.4. Стандартни разтвори на стронций

3.4.1. Основен стандартен разтвор на стронций - 1000 mg/cm3 (ml) в 0,5 М разтвор на азотна киселина (Spectrosol или еквивалентен).

3.4.2. Работен стандартен разтвор на стронций - 100 mg/cm3 (ml): в мерителна колба 100 cm3 (ml) се прехвърлят с пипета 10,0 cm3 (ml) от основния стандартен разтвор на стронций (3.4.1). Долива се до марката с 0,07 М разтвор на солна киселина (3.2) и се разбърква.

4. Апаратура

4.1. Стандартно лабораторно оборудване.

4.2. Мембранен филтър с големина на порите 0,45 mm.

4.3. Атомно-абсорбционен спектрометър със стронциева лампа (кухокатодна).

5. Процедура

5.1. Приготвяне на пробата

Разтворът, получен в А.5.1.4, се използва за определянето на разтворим стронций.

5.1.1. В мерителна колба 100 cm3 (ml) с пипета се прехвърлят 5,0 cm3 (ml) разтвор на калиев хлорид (3.3) и аликвотно количество (WSr cm3 (ml) от разредения филтрат (A.5.1.4), така че да се получи предполагаема концентрация на стронций между 2 и 5 mg/cm3 (ml) (аликвотна част от 25 cm3 (ml) е добра отправна точка). Долива се до марката с 0,07 М разтвор на солна киселина (3.2) и се разбърква.

5.1.2. Концентрацията на стронций в разтвора (5.1.1) се определя чрез атомно-абсорбционна спектрометрия същия ден.

5.2. Условия за атомно-абсорбционна спектрометрия.

Пламък - азотен оксид/ацетилен

Дължина на вълната - 460,7 nm

Процеп - 0,2 nm

Корекция на фона - не

Условия на горене - редукционен пламък; за максимална абсорбция е необходимо оптимизиране на височината на горелката и газовата смес.

5.3. Стандартна крива

5.3.1. В мерителни колби 100 cm3 (ml) се поставят с пипета 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 и 5,0 cm3 (ml) от работния стандартен разтвор на стронций (3.4.2). Във всяка колба с пипета се прибавят 5,0 cm3 (ml) разтвор на калиев хлорид (3.3), обемът се долива до марката с 0,07 М разтвор на солна киселина (3.2) и се разбърква. Тези разтвори съдържат съответно 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 и 5,0 mg/cm3 (ml) стронций. По същия начин се приготвя празна проба, без да се прибавя стандартен разтвор на стронций.

5.3.2. Измерва се абсорбцията на празната проба (5.3.1) и получената стойност се използва като нулева концентрация на стронций за стандартната крива. Измерва се абсорбцията на всеки стандартен разтвор на стронций (5.3.1). Построява се стандартна крива, като се нанасят стойностите на абсорбцията спрямо концентрацията на стронций.

5.4. Определяне.

Измерва се абсорбцията на пробата (5.1.1). От стандартната крива се отчита концентрацията на стронций, съответстваща на абсорбцията, получена за разтвора на пробата.

6. Изчисления

Съдържанието на разтворим стронций в пигмента се изчислява в % (M/M) по формулата:

	c x V
% (M/M) разтворим стронций =	____________,
	10 x WSr x M

където:

M е масата на пробата, взета за анализ (А.5.1.1), в g;

с - концентрацията на стронций в разтвора на пробата (5.1.1), отчетена от стандартната крива, в mg/cm3 (ml);

V - общият обем на извлека (А.5.1.2) в cm3 (ml);

WSr - обемът на екстракта (взет в Б.5.1.1) в cm3 (ml).

7. Повторяемост (виж ISO 5725)

Най-добрата възможна повторяемост за този метод е 0,09 % при съдържание на разтворим стронций 0,6 % (M/M).

8. Забележка

Като алтернативен метод на пламъковата атомно-абсорбционна спектрометрия се допуска атомно-емисионна спектрометрия с индуктивно свързана плазма (ICP-AES).

ХХХIII. Идентификация и определяне на бензилов алкохол в козметични продукти

А. Идентификация

1. Област на приложение

Методът се отнася за идентификация на бензилов алкохол в козметични продукти.

2. Принцип

Бензиловият алкохол се идентифицира чрез тънкослойна хроматография на плаки със силикагел.

3. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.).

3.1. Бензилов алкохол.

3.2. Хлороформ.

3.3. Етанол, абсолютен.

3.4. n-Пентан.

3.5. Подвижна фаза: диетилов етер.

3.6. Стандартен разтвор на бензилов алкохол: в мерителна колба 100 cm3 (ml) се претегля 0,1 g бензилов алкохол (3.1) и се долива до марката с етанол (3.3). Разбърква се.

3.7. Плаки за тънкослойна хроматография, стъклени, 10 x 20 сm или 20 x 20 сm, покрити със слой от силикагел 60 F254 с дебелина 0,25 mm.

3.8. Реактив за проявяване на петната: 12-молибденофосфорна киселина, 10 % (M/V) в етанол (3.3).

4. Апаратура

4.1. Стандартно оборудване за тънкослойна хроматография.

4.2. Хроматографска вана с две отделения, с размери приблизително 8 x 23 x 24 сm.

4.3. Хроматографска хартия Whatman или еквивалентна.

4.4. УВ лампа с дължина на вълната 254 nm.

5. Процедура

5.1. Приготвяне на пробата

В мерителна колба 100 cm3 (ml) се претегля 1,0 g от продукта, който ще се анализира. Прибавят се 3 cm3 (ml) хлороформ (3.2) и се разклаща енергично за диспергиране на продукта. Долива се до марката с етанол (3.3) и се разклаща енергично до получаване на бистър или почти бистър разтвор.

5.2. Тънкослойна хроматография

5.2.1. Хроматографската вана (4.2) се насища с n-пентан (3.4), както следва: стената на ваната, съседна на задното отделение, се облицова с хроматографска хартия (4.3), така че долният край на хартията да влиза в това отделение. В задното отделение се наливат 25 cm3 (ml) n-пентан (3.4), като последният се сипва по откритата повърхност на облицоващата хроматографска хартия. Веднага се поставя капакът и ваната се оставя да престои 15 min.

5.2.2. На подходящи точки на стартовата линия на хроматографската плака (3.7) се нанасят 10 ml от разтвора на пробата (5.1) и 10 ml от стандартния разтвор на бензилов алкохол (3.6). Оставя се да изсъхне.

5.2.3. В предното отделение на ваната с пипета се поставят 10 cm3 (ml) диетилов етер (3.5) и веднага след това в същото отделение се поставя плаката. Бързо се поставя капакът и хроматограмата се развива до разстояние 15 сm от стартовата линия. Плаката се изважда от хроматографската вана и се суши при стайна температура.

5.2.4. Плаката (5.2.3) се разглежда под ултравиолетова светлина и се отбелязват местата на виолетовите петна. Плаката се напръсква с проявяващ реактив (3.8) и след това се нагрява в продължение на 15 min при 120 градуса С. Бензиловият алкохол се появява като тъмносиньо петно.

5.2.5. Изчислява се получената Rf-стойност за стандартния разтвор на бензилов алкохол. Тъмносиньо петно със същата Rf-стойност, получено от разтвора на пробата, показва присъствие на бензилов алкохол.

Откриваем минимум - 0,1 mg бензилов алкохол.

Б. Определяне

1. Област на приложение

Този метод се отнася за определянето на бензилов алкохол в козметични продукти.

2. Дефиниция

Количеството на бензиловия алкохол, определено по този метод, се изразява в % (М/М).

3. Принцип

Пробата се екстрахира с метанол и количеството на бензиловия алкохол в екстракта се определя чрез високоефективна течна хроматография (ВЕТХ).

4. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "за ВЕТХ", а водата - бидестилирана.

4.1. Метанол.

4.2. 4-етоксифенол.

4.3. Бензилов алкохол.

4.4. Подвижна фаза: метанол (4.1)/вода = 45 : 55 (V/V).

4.5. Основен разтвор на бензилов алкохол: в мерителна колба 100 cm3 (ml) се претеглят около 0,1g бензилов алкохол (4.3) с точност 0,001 g. Долива се до марката с метанол (4.1) и се разбърква.

4.6. Основен разтвор на вътрешен стандарт: в мерителна колба 100 cm3 (ml) се претеглят около 0,1 g 4-етоксифенол (4.2) с точност 0,001 g. Долива се до марката с метанол (4.1) и се разбърква.

4.7. Стандартни разтвори: в серия от мерителни колби от 25 cm3 (ml) се поставят съответни количества от основния разтвор на бензилов алкохол (4.5) и от основния разтвор на вътрешен стандарт (4.6) съгласно таблицата, дадена по-долу. Доливат се до марката с метанол (4.1) и разтворите се разбъркват.

Тези стойности са дадени за информация и съответстват на концентрациите на стандартните разтвори, приготвени с използване на разтвори на бензилов алкохол (4.5) и на 4-етоксифенол (4.6), които съдържат съответно точно 0,1 % (M/V) бензилов алкохол и 0,1 % (M/V) 4-етоксифенол.

Стан-	Концентрация	Концентрация
дартен	на бензилов	на 4-етоксифенол
разтвор	алкохол

	добавени		добавени
	cm3 (ml)	mg/cm3 (ml)	cm3 (ml)	mg/cm3 (ml)
	(4.5)		(4.6)
I	0,5	20	2,0	80
II	1,0	40	2,0	80
III	2,0	80	2,0	80
IV	3,0	120	2,0	80
V	5,0	200	2,0	80

5. Апаратура

5.1. Стандартно лабораторно оборудване.

5.2. Течен хроматограф (ВЕТХ) с УВ детектор с променлива дължина на вълната и 10 ml дозаторна капиляра.

5.3. Аналитична колона: 250 mm x 4,6 mm, от неръждаема стомана, с пълнеж Spherisorb ODS 5 mm или еквивалентен.

5.4. Водна баня.

5.5. Ултразвукова вана.

5.6. Центрофуга.

5.7. Центрофужни епруветки с обем 15 сm3 (ml).

6. Процедура

6.1. Приготвяне на пробата

6.1.1. В центрофужна епруветка (5.7) се претегля около 0,1 g (М) с точност 0,001 g от пробата и се прибавят 5 cm3 (ml) метанол (4.1).

6.1.2. Загрява се 10 min на водна баня (5.4) при температура 50 градуса С, след което епруветката се поставя в ултразвукова вана (5.5), където престоява до пълно диспергиране на пробата.

6.1.3. Охлажда се и след това се центрофугира при 3500 rрm в продължение на 5 min.

6.1.4. Бистрата течност се прехвърля в мерителна колба от 25 cm3 (ml).

6.1.5. Пробата се екстрахира повторно с 5 cm3 (ml) метанол (4.1). Екстрактите се обединяват в мерителната колба от 25 cm3 (ml).

6.1.6. В мерителната колба 25 cm3 (ml) се прибавят с пипета 2,0 cm3 (ml) от основния разтвор на вътрешен стандарт (4.6). Долива се до марката с метанол (4.1) и се разбърква. Този разтвор се използва за определянето, описано в 6.4.

6.2. Хроматографиране

6.2.1. Течният хроматограф (5.2) се настройва по обичайния начин. Потокът на подвижната фаза се нагласява на 2,0 cm3 (ml)/min.

6.2.2. Дължината на вълната на УВ детектора се нагласява на 210 nm.

6.3. Стандартна крива

6.3.1. Дозират се по 10 ml от всеки от стандартните разтвори на бензилов алкохол (4.7) и се измерват площите на пиковете на бензиловия алкохол и на 4-етоксифенола.

6.3.2. За всеки от стандартните разтвори на бензилов алкохол (4.7) се изчислява отношението на площта на пика на бензиловия алкохол към този на 4-етоксифенола. Построява се стандартна крива, като тези отношения се нанасят по ординатата, а съответните концентрации на бензилов алкохол в mg/сm3 (ml) - по абсцисата.

6.4. Определяне

6.4.1. Инжектират се 10 ml от разтвора на пробата (6.1.6) и се измерват площите на пиковете на бензиловия алкохол и на 4-етоксифенола. Изчислява се отношението между площите на пиковете на бензиловия алкохол и на 4-етоксифенола. Тази процедура се повтаря с нови 10 ml порции от разтвора на пробата, докато се получат стабилни резултати.

6.4.2. От стандартната крива (6.3.2) се отчита концентрацията на бензиловия алкохол, съответстваща на полученото отношение на площите на бензиловия алкохол към 4-етоксифенола.

7. Изчисления

Съдържанието на бензилов алкохол в пробата, като % (M/M), се изчислява по следната формула:

	c
% (M/M) бензилов алкохол =	________,
	400 x M

където:

М е масата на пробата, взета за анализ (6.1.1), в g;

с - концентрацията на бензилов алкохол в разтвора на пробата (6.1.6), определена по стандартната крива в mg/сm3 (ml).

8. Повторяемост (виж ISO 5725)

За съдържание на бензилов алкохол от 1 % (M/M) разликата между две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава 0,10 %.

ХХХIV. Идентификация на цирконий и oпределяне на цирконий, алуминий и хлор в неаерозолни антиперспиранти

Методът включва пет етапа:

А. Идентификация на цирконий

Б. Определяне на цирконий

В. Определяне на алуминий

Г. Определяне на хлор

Д. Изчисляване на съотношенията на алуминиеви към циркониеви атоми и алуминиеви плюс циркониеви атоми към хлорни атоми.

А. Идентификация на цирконий

1. Област на приложение

Този метод се отнася за идентификацията на цирконий в неаeрoзолни антиперспиранти. Не е направен опит за описване на методи, подходящи за идентификация на алуминиево-циркониевия хлоридно-хидроксиден комплекс [AlXZr(OH)YClZ.nH2O].

2. Принцип

Цирконият се идентифицира по характерната червено-виолетова утайка, която се образува с ализариново червено S в силно кисела среда.

3. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.

3.1. Солна киселина - концентрирана (d20 = 1,18 g/cm3 (ml).

3.2. Разтвор на ализариново червено S (CI 58005) : 2 % (М/V) воден разтвор на натриев ализарин сулфонат.

4. Апаратура

4.1. Стандартно лабораторно оборудване.

5. Процедура

5.1. Към около 1 g от пробата се прибавят 2 cm3 (ml) вода в епруветка. Епруветката се запушва и се разклаща.

5.2. Прибавят се три капки разтвор на ализариново червено S (3.2) и след това - 2 cm3 (ml) концентрирана солна киселина (3.1). Епруветката се запушва и се разклаща.

5.3. Оставя се да престои около 2 min.

5.4. Червено-виолетовото оцветяване на разтвора и утайката показва присъствие на цирконий.

Б. Определяне на цирконий

1. Област на приложение

Този метод се отнася за определяне на цирконий в алуминиево-циркониеви хлоридно-хидроксидни комплекси до максимална концентрация 7,5 % (M/M) цирконий в неаерозолни антиперспиранти.

2. Принцип

Цирконият се екстрахира от продукта в силно кисела среда и се определя чрез атомно-абсорбционна спектрометрия.

3. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - бидестилирана.

3.1. Солна киселина - концентрирана (d20 = 1,18 g/cm3 (ml).

3.2. Солна киселина - 10 % (V/V): в стъклена чаша се наливат 500 cm3 (ml) вода и се прибавят 100 cm3 (ml) концентрирана солна киселина (3.1) при непрекъснато разбъркване. Този разтвор се прехвърля в мерителна колба от 1 dm3 (l) и се долива до марката с вода.

3.3. Основен стандартен разтвор на цирконий - 1000 mg/cm3 (ml) в 0,5 М разтвор на солна киселина (Spectrosol или еквивалентен).

3.4. Разтвор на алуминиев хлорид (хидратиран) (AlCl3.6H2O): 22,6 g алуминиев хлорид хексахидрат се разтварят в 250 cm3 (ml) 10 % (V/V) разтвор на солна киселина (3.2).

3.5. Разтвор на амониев хлорид: 5,0 g амониев хлорид се разтварят в 250 cm3 (ml) 10 % (V/V) разтвор на солна киселина (3.2).

4. Апаратура

4.1. Стандартно лабораторно оборудване.

4.2. Магнитна бъркалка с нагревател.

4.3. Филтърна хартия (Whatman № 41 или еквивалентна).

4.4. Атомно-абсорбционен спектрометър с циркониева лампа (кухокатодна).

5. Процедура

5.1. Приготвяне на пробата

5.1.1. Претегля се около 1,0 g (М) с точност 0,001g от хомогенизираната проба от продукта в стъклена чаша от 150 cm3 (ml). Прибавят се 40 cm3 (ml) вода и 10 cm3 (ml) концентрирана солна киселина (3.1).

5.1.2. Чашата се поставя на магнитната бъркалка (4.2) и започва разбъркване и нагряване до кипене. За да се избегне бързото изсушаване, чашата се покрива с часовниково стъкло. След кипене 5 min, чашата се сваля от бъркалката и се охлажда до стайна температура.

5.1.3. Съдържанието на чашата се филтрува през филтърна хартия (4.3) в мерителна колба 100 cm3 (ml). Чашата се промива два пъти с по 10 cm3 (ml) вода и промивните води, след филтруване, се прибавят в колбата. Долива се до марката с вода и се разбърква. Този разтвор се използва и за определяне на алуминий (част В).

5.1.4. 20,00 cm3 (ml) от разтвора на пробата (5.1.3) се прехвърлят с пипета в мерителна колба 50 cm3 (ml). Прибавят се 5,00 cm3 (ml) разтвор на алуминиев хлорид (3.4) и 5,00 cm3 (ml) разтвор на амониев хлорид (3.5). Долива се до марката с 10 % (V/V) разтвор на солна киселина (3.2) и се разбърква.

5.2. Условия за атомно-абсорбционна спектрометрия

Пламък - азотен оксид/ацетилен

Дължина на вълната - 360,1 nm

Корекция на фона - не

Процеп - 0,2 nm

Условия на горене - редукционен пламък; за максимална абсорбция е необходимо оптимизиране на височината на горелката и газовата смес.

5.3. Стандартна крива

5.3.1. В серия мерителни колби 50 cm3 (ml) се поставят с пипета 5,00; 10,00; 15,00; 20,00 и 25,00 cm3 (ml) от основния стандартен разтвор на цирконий (3.3). Във всяка колба с пипета се прибавят 5,0 cm3 (ml) разтвор на алуминиев хлорид (3.4) и 5,00 cm3 (ml) разтвор на амониев хлорид (3.5). Долива се до марката с 10 % (V/V) разтвор на солна киселина (3.2) и се разбърква. Тези разтвори съдържат съответно 100; 200; 300; 400 и 500 mg/cm3 (ml) цирконий.

По същия начин се приготвя празна проба, без да се прибавя стандартен разтвор на цирконий.

5.3.2. Измерва се абсорбцията на празната проба (5.3.1) и получената стойност се използва като нулева концентрация на цирконий за стандартната крива. Измерва се абсорбцията на всеки стандартен разтвор на цирконий (5.3.1). Построява се стандартна крива, като се нанасят стойностите на абсорбцията спрямо концентрацията на цирконий.

5.4. Определяне.

Измерва се абсорбцията на пробата (5.1.4). От стандартната крива се отчита концентрацията на цирконий, съответстваща на абсорбцията, получена за разтвора на пробата.

6. Изчисления

Съдържанието на цирконий в пробата се изчислява в % (M/M) по формулата:

	c
% (M/M) цирконий =	_______,
	40 x M

където:

M е масата на пробата, взета за анализ (5.1.1), в g;

с - концентрацията на цирконий в разтвора на пробата (5.1.4), отчетена от стандартната крива, в mg/cm3 (ml).

7. Повторяемост (виж ISO 5725)

За съдържание на цирконий 1,00 % (M/M) разликата между две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава 0,10 % (M/M).

8. Забележка

Като алтернативен метод на пламъковата атомно-абсорбционна спектрометрия се допуска атомно-емисионна спектрометрия с индуктивно свързана плазма (ICP-AES).

В. Определяне на алуминий

1. Област на приложение

Този метод е подходящ за определяне на алуминий в алуминиево-циркониеви хлоридно-хидроксидни комплекси до максимална концентрация 12 % (M/M) алуминий в неаерозолни антиперспиранти.

2. Принцип

Алуминият се екстрахира от продукта в силно кисела среда и се определя чрез атомно-абсорбционна спектрометрия.

3. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - бидестилирана.

3.1. Солна киселина - концентрирана (d20 = 1,18 g/cm3 (ml).

3.2. Разтвор на солна киселина - 1 % (V/V): в стъклена чаша се наливат 500 cm3 (ml) вода и се прибавят 10 cm3 (ml) концентрирана солна киселина (3.1) при непрекъснато разбъркване. Този разтвор се прехвърля в мерителна колба от един литър и се долива до марката с вода.

3.3. Основен стандартен разтвор на алуминий - 1000 mg/cm3 (ml) в 0,5 М разтвор на солна киселина (Spectrosol или еквивалентен).

3.4. Реактив калиев хлорид: 10,0 g калиев хлорид се разтварят в 250 cm3 (ml) 1 % (V/V) разтвор на солна киселина (3.2).

4. Апаратура

4.1. Стандартно лабораторно оборудване.

4.2. Атомно-абсорбционен спектрометър с алуминиева лампа (кухокатодна).

5. Процедура

5.1. Приготвяне на пробата

Разтворът, приготвен във В.5.1.3, се използва за определяне съдържанието на алуминий.

5.1.1. 5,00 cm3 (ml) от разтвора на пробата (В.5.1.3) се прехвърлят с пипета в мерителна колба 100 cm3 (ml) и се прибавят 10,00 cm3 (ml) реактив калиев хлорид (3.4). Долива се до марката с 1 % (V/V) разтвор на солна киселина (3.2) и се разбърква.

5.2. Условия за атомно-абсорбционна спектрометрия

Пламък - азотен оксид / ацетилен

Дължина на вълната - 309,3 nm

Процеп - 0,7 nm

Корекция на фона - не

Условия на горене - редукционен пламък; за максимална абсорбция е необходимо оптимизиране на височината на горелката и подаването на газовата смес.

5.3. Стандартна крива

5.3.1. В серия мерителни колби 100 cm3 (ml) се поставят с пипета 1,00; 2,00; 3,00; 4,00 и 5,00 cm3 (ml) от основния стандартен разтвор на алуминий (3.3). Във всяка колба с пипета се прибавят по 10,00 cm3 (ml) реактив калиев хлорид (3.4), долива се до марката с 1 % (V/V) разтвор на солна киселина (3.2) и се разбърква. Тези разтвори съдържат съответно 10; 20; 30; 40 и 50 mg/cm3 (ml) алуминий.

По същия начин се приготвя празна проба, без да се прибавя стандартен разтвор на алуминий.

5.3.2. Измерва се абсорбцията на празната проба (5.3.1) и получената стойност се използва като нулева концентрация на алуминий за стандартната крива. Измерва се абсорбцията на всеки стандартен разтвор на алуминий (5.3.1). Построява се стандартна крива, като се нанасят стойностите на абсорбцията спрямо концентрацията на алуминий.

5.4. Определяне.

Измерва се абсорбцията на пробата (5.1.1). От стандартната крива се отчита концентрацията на алуминий, съответстваща на абсорбцията, получена за разтвора на пробата.

6. Изчисления

Съдържанието на алуминий в пробата се изчислява в % (M/M) по формулата:

	c
% (M/M) =	_____,
	5 x M

където:

M е масата на пробата, взета за анализ (Б.5.1.1), в g;

с - концентрацията на алуминий в разтвора на пробата (5.1.1), отчетена от стандартната крива, в mg/cm3 (ml).

7. Повторяемост (виж ISO 5725)

За съдържание на алуминий 3,5 % (M/M) разликата между две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава 0,10 % (M/M).

8. Забележка

Като алтернативен метод на пламъковата атомно-абсорбционна спектрометрия се допуска атомно-емисионна спектрометрия с индуктивно свързана плазма (ICP-AES).

Г. Определяне на хлор

1. Област на приложение

Този метод се отнася за определяне на хлор, присъстващ като хлорен йон в алуминиево-циркониеви хлоридно-хидроксидни комплекси в неаерозолни антиперспиранти.

2. Принцип

Хлорният йон в продукта се определя чрез потенциометрично титруване със стандартен разтвор на сребърен нитрат.

3. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.

3.1. Азотна киселина - концентрирана (d20 = 1,42 g/cm3 (ml).

3.2. Азотна киселина - 5 % (V/V): 25 cm3 (ml) концентрирана азотна киселина (3.1) се прибавят към 250 cm3 (ml) вода в стъклена чаша при непрекъснато разбъркване. Този разтвор се прехвърля в мерителна колба от 500 cm3 (ml) и се долива до марката с вода.

3.3. Ацетон.

3.4. Сребърен нитрат - 0,1 М стандартен разтвор (AnalaR или еквивалентен).

4. Апаратура

4.1. Стандартно лабораторно оборудване.

4.2. Магнитна бъркалка с нагревател.

4.3. Сребърен електрод.

4.4. Каломелов сравнителен електрод.

4.5. рН-миливолтметър, подходящ за потенциометрично титруване.

5. Процедура

5.1. Приготвяне на пробата

5.1.1. В стъклена чаша 250 cm3 (ml) се претегля около 1,0 g (М) с точност 0,001 g от хомогенизираната проба на продукта. Прибавят се 80 cm3 (ml) вода и 20 cm3 (ml) 5 % (V/V) разтвор на азотна киселина (3.2).

5.1.2. Чашата се поставя на магнитната бъркалка (4.2). Започва разбъркване и нагряване до кипене. За да се избегне бързото изсушаване, чашата се покрива с часовниково стъкло. Кипи се 5 min, чашата се сваля от бъркалката и се охлажда до стайна температура.

5.1.3. Прибавят се 10 cm3 (ml) ацетон (3.3), потапят се електродите (4.3 и 4.4) под повърхността и се започва разбъркване. Титрува се потенциометрично с 0,1 М разтвор на сребърен нитрат (3.4) и се построява диференциална крива за определяне на еквивалентния пункт (V cm3 (ml).

6. Изчисления

Съдържанието на хлор в пробата в % (M/M) се изчислява по формулата:

	0,3545 x V
% (M/M) хлор =	__________,
	M

където:

M е масата на пробата, взета за анализ (5.1.1), в g;

V - обемът на 0,1 М разтвор на сребърен нитрат, изразходван до еквивалентния пункт (5.1.3), в cm3 (ml).

7. Повторяемост (виж ISO 5725)

За съдържание на хлор 4 % (M/M) разликата между две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава 0,10 % (M/M).

Д. Изчисляване на отношенията на алуминиеви атоми към циркониеви атоми и алуминиеви плюс циркониеви атоми към хлорни атоми

1. Изчисляване на отношението алуминиеви атоми към циркониеви атоми

Отношението Al : Zr се изчислява по формулата:

	Al %(M/M) x 91,22
Отношение Al :	Zr = ___________________________________________________________
	Zr %(M/M) x 26,98

2. Изчисляване на отношението алуминиеви плюс циркониеви атоми към хлорни атоми

Отношението (Al + Zr) : Cl се изчислява по формулата:

	Al %(M/M)		Zr %(M/M)
	___________________________	+	___________________________
	26,98		91,22

Oтношение (Al + Zr) : Cl =	______________________________________________________________
	Cl %(M/M)
	______________________________________________________________
	35,45

ХХХV. Идентификация и определяне на хексамидин, дибромохексамидин, дибромопропамидин и хлорхексидин

1. Област на приложение

Методът се отнася за качественото и количественото определяне на:

- хексамидин и неговите соли, вкл. изетионат и 4-хидрокси бензоат,

- дибромохексамидин и негови соли, вкл. изетионат,

- дибромопропамидин и негови соли, вкл. изетионат,

- хлорхексидин диацетат, диглюконат и дихидрохлорид в козметични продукти.

2. Дефиниция

Концентрациите на хексамидин, дибромохексамидин, дибромопропамидин и хлорхексидин, определени по този метод, се изразяват в % (M/M).

3. Принцип

Идентифицикацията и определянето се извършва чрез обратнофазова високо ефективна течна хроматография (ВЕТХ) c УВ детектор. Хексамидин, дибромохексамидин, дибромопропамидин и хлорхексидин се идентифицират по техните времена на задържане в хроматографската колона.

4. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "за ВЕТХ", а водата - бидестилирана.

4.1. Метанол

4.2. 1-Хептансулфонова киселина, натриева сол, монохидрат

4.3. Оцетна киселина, ледена (d20 = 1,05 g/cm3 (ml)

4.4. Натриев хлорид

4.5. Подвижни фази

4.5.1. Разтворител I: 0,005 М разтвор на 1-хептансулфонова киселина, натриева сол, монохидрат (4.2) в метанол (4.1), доведен до рН 3,5 с ледена оцетна киселина (4.3).

4.5.2. Разтворител II: 0,005 М разтвор на 1-хептансулфонова киселина, натриева сол, монохидрат (4.2) във вода, доведен до рН 3,5 с ледена оцетна киселина (4.3).

Забележка: Ако е необходимо да се подобри формата на пиковете, подвижните фази могат да се модифицират и приготвят, както следва:

- Разтворител I: разтварят се 5,84 g натриев хлорид (4.4) и 1,1013g 1-хептансулфонова киселина, натриева сол, монохидрат (4.2) в 100 cm3 (ml) вода. Прибавят се 900 cm3 (ml) метанол (4.1) и се довежда до рН 3,5 с ледена оцетна киселина (4.3).

- Разтворител II: разтварят се 5,84 g натриев хлорид (4.4) и 1,1013 g 1-хептансулфонова киселина, натриева сол, монохидрат (4.2) в 1 dm3 (l) вода и се довежда до рН 3,5 с ледена оцетна киселина (4.3).

4.6. Хексамидин диизетионат [C20H26N4O2.2C2H6O4S]

4.7. Дибромохексамидин диизетионат [C20H26Br2N4O2.2C2H6O4S]

4.8. Дибромопропамидин диизетионат [C17H18Br2N4O2.2C2H6O4S]

4.9. Хлорхексидин диацетат [C22H30Cl2N10.2C2H4O2]

4.10. Стандартни разтвори: приготвят се 0,05 % (М/V) разтвори на всеки от четирите консерванта (4.6 до 4.9) в разтворител I (4.5.1).

4.11. 3,4,4x-Трихлорокарбанилид/триклокарбан/

4.12. 4,4x-Дихлоро-3-/трифлуорометил/карбанилид/халокарбан/

5. Апаратура

5.1. Стандартно лабораторно оборудване

5.2. Високо ефективен течен хроматограф с УВ детектор с варираща дължина на вълната

5.3. Аналитична колона: неръждаема стомана, дължина - 30 сm; вътрешен диаметър - 4 mm; напълнена с m-Bondapack С18, 10 mm или подобен.

5.4. Ултразвукова вана

6. Идентификация

6.1. Подготовка на пробата: претеглят се около 0,5 g от пробата с точност 0,001 g в 10 cm3 (ml) мерителна колба и се долива до марката с разтворител I (4.5.1). Колбата се поставя в ултразвукова вана (5.4) за 10 min. Разтворът се филтрува или центрофугира. Филтратът се отделя за хроматографски анализ.

6.2. Хроматография

6.2.1. Градиент на подвижната фаза

Време	Разтворител I	Разтворител II
(min)	(% V/V) (4.5.1)	(% V/V) (4.5.2)
0	50	50
15	65	35
30	65	35
45	50	50

6.2.2. Скорост на потока на подвижната фаза (6.2.1) до 1,5 cm3 (ml)/min и температура на колоната до 35 градуса С.

6.2.3. Дължина на вълната на детектора - 264 nm.

6.2.4. Инжектират се 10 ml от всеки стандартен разтвор (4.10) и се записват хроматограмите им.

6.2.5. Инжектират се 10 ml от разтвора на пробата (6.1) и се записва хроматограмата.

6.3. Идентифицира се присъствието на хексамидин, дибромохексамидин, дибромопропамидин или хлорхексидин, като се сравняват времената на задържане на записаните пикове в 6.2.5 с тези, получени от стандартните разтвори в 6.2.4.

7. Определяне

7.1. Подготовка на стандартни разтвори. Използва се един от консервантите (4.6 до 4.9), който липсва в мострата, като вътрешен стандарт. Ако това не е възможно, препоръчва се да се използва триклокарбан (4.11) или халокарбан (4.12).

7.1.1. Изходен разтвор на консерванта - 0,05 % (М/V), идентифициран в 6.3, в разтворител I (4.5.1).

7.1.2. Изходен разтвор на консерванта - 0,05 % (М/V), избран като вътрешен стандарт, в разтворител I (4.5.1).

7.1.3. За всеки идентифициран консервант се приготвят 4 стандартни разтвора, като се отмерват в серия от 10 сm3 (ml) мерителни колби подходящи количества от изходния разтвор на идентифицирания консервант (7.1.1) и подходящи количества от изходния разтвор на вътрешния стандарт (7.1.2) според долната таблица. Всяка колба се долива до необходимия обем с разтворител I (4.5.1) и се разбърква.

Стандартен	Вътрешен	Изходен разтвор на
разтвор	стандартен	идентифицирания
	изходен разтвор	консервант

		добавени
	добавени сm3 (ml)	сm3 (ml)	mg/cm3 (ml)
	(7.1.2)	(7.1.1)	(*)
I	1,0	0,5	25
II	1,0	1,0	50
III	1,0	1,5	75
IV	1,0	2,0	100

(*) Тези стойности са дадени като индикация и отговарят на концентрациите на идентифицираните консерванти в приготвените стандартни разтвори, изхождайки от изходния разтвор, съдържащ точно 0,05 % от идентифицирания консервант.

7.2. Подготовка на пробата

7.2.1. Претегля се около 0,5 g (р) с точност 0,001 g от пробата в мерителна колба 10 cm3 (ml), добавят се 1,0 cm3 (ml) от вътрешния стандартен разтвор (7.1.2) и 6 cm3 (ml) от разтворител I (4.5.1) и се разбърква.

7.2.2. Колбата се поставя в ултразвукова вана (5.4) за 10 min. Охлажда се. Долива се до необходимия обем с разтворител I и се разбърква. Центрофугира се или се филтрува през нагъната филтърна хартия. Събира се горната фаза или филтратът за хроматографиране.

7.3. Хроматография

7.3.1. Градиентът на подвижната фаза, скоростта на потока, температурата на колоната и дължината на вълната на детектора на HPLC (5.2), са както е препоръчано при етап идентификация (6.2.1 до 6.2.3).

7.3.2. Инжектират се 10 ml от разтвора на пробата (7.2.2) и се измерват пиковите площи. Повтаря се процесът с инжектиране на 10 ml от разтвора на пробата, докато се получат постоянни резултати. Изчислява се съотношението на пиковата площ, получена от анализираната проба, с пиковата площ, получена от вътрешния стандарт.

7.4. Калибриране

7.4.1. Инжектират се 10 ml от всички стандартни разтвори (7.1.3) и се измерват пиковите площи.

7.4.2. За всеки стандартен разтвор (7.1.3) се изчислява съотношението на пиковите площи на хексамидина, дибромохексамидина, дибромопропамидина или хлорхексидина спрямо пиковата площ на вътрешния стандарт. Начертава се стандартна крива, като на ординатата се нанасят тези съотношения, а на абсцисата - съответните концентрации на идентифицираните консерванти в стандартните разтвори, в mg/cm3 (ml).

7.4.3. От стандартната крива (7.4.2) се отчитат концентрациите на идентифицираните консерванти, съответстващи на изчислените пикови площи в 7.3.2.

8. Изчисления

8.1.1.Съдържанието на хексамидин, дибромохексамидин, дибромопропамидин или хлорхексидин в пробата като % (M/M) се изчислява по следната формула:

		c		МW1
% (M/M)	=	____________________________	x	____,
		1000 x p		МW2

където:

р е масата на анализираната проба (7.2.1) в g;

с - концентрацията на консерванта в разтвора на пробата, отчетена от стандартната крива, в mg/cm3 (ml);

МW1 - молекулното тегло на основната форма присъстващ консервант;

МW2 - молекулното тегло на съответната сол (виж т. 10).

9. Повторяемост (виж ISO 5725)

За концентрация 0,1 % (М/М) на хексамидина, дибромохексамидина, дибромопропамидина или хлорхексидина разликата в резултатите на две паралелно проведени определения на една и съща проба не трябва да надвишава 0,005 %.

10. Таблица на консервантите със съответните формули и молекулни тегла:

Хексамидин	C20H26N4O2	354,45
Хексамидин диизетионат	C20H26N4O2.2C2H6O4S	606,72
Хексамидин ди-р-хидроксибензоат	C20H26N4O2.2C7H6O3	630,71
Дибромохексамидин	C20H24Br2N4O2	512,24
Дибромохексамидин диизетионат	C20H24Br2N4O2. 2C2H6O4S	764,51
Дибромопропамидин	C17H18 Br2N4O2	470,18
Дибромопропамидин диизетионат	C17H18 Br2N4O2. 2C2H6O4S	722,43
Хлорхексидин	C22H30Cl2N10.	505,45
Хлорхексидин диацетат	C22H30Cl2N10.2C2H4O2	625,56
Хлорхексидин диглюконат	C22H30Cl2N10.2C6H12O7	897,76
Хлорхексидин дихидрохлорид	C22H30Cl2N10.2HCl	578,37

ХХХVI. Идентификация и определяне на бензоена киселина, 4-хидроксибензоена киселина, сорбинова киселина, салицилова киселина и пропионова киселина в козметични продукти

1. Област на приложение

Методът се отнася за идентификация и определяне на бензоена киселина, 4-хидроксибензоена киселина, сорбинова киселина, салицилова киселина и пропионова киселина в козметични продукти. Отделни процедури описват идентификацията на тези консерванти; определянето на пропионова киселина, 4-хидроксибензоена киселина, салицилова киселина, сорбинова киселина и бензоена киселина.

2. Дефиниция

Количествата на бензоена киселина, 4-хидроксибензоена киселина, сорбинова киселина, салицилова киселина и пропионова киселина, определени по този метод, се изразяват като % (M/M) на свободните киселини.

А. Идентификация

1. Принцип

След киселинно-основна екстракция на консервантите екстрактът се анализира чрез тънкослойна хроматография (ТСХ), използвайки непосредствена дериватизация. В зависимост от резултатите идентификацията се потвърждава чрез високоефективна течна хроматография (ВЕТХ) или за пропионовата киселина чрез газова хроматография.

2. Реактиви

2.1. Общо изискване

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.

2.2. Ацетон.

2.3. Диетилов етер.

2.4. Ацетонитрил.

2.5. Толуен.

2.6. n-Хексан.

2.7. Парафин, течен.

2.8. Солна киселина - 4 М.

2.9. Калиев хидроксид - 4 М.

2.10. Калциев хлорид, CaCl2.2H2O.

2.11. Литиев карбонат, Li2CO3.

2.12. 2-Бром-2x-ацетонафтон.

2.13. 4-Хидроксибензоена киселина.

2.14. Салицилова киселина.

2.15. Бензоена киселина.

2.16. Сорбинова киселина.

2.17. Пропионова киселина.

2.18. Сравнителни разтвори

Приготвят се 0,1 % (M/V) разтвори (100 mg/100 cm3 (ml) от всеки от петте консерванта (2.13 до 2.17) в диетилов етер.

2.19. Реактив за дериватизация

0,5 % (M/V) разтвор на 2-бром-2xацетонафтон (2.12) в ацетонитрил (2.4) (50 mg/10 cm3 (ml). Този разтвор се приготвя непосредствено преди употреба.

2.20. Разтвор на катализатор

0,3 % (M/V) разтвор на литиев карбонат (2.11) във вода (300 mg/100 cm3 (ml). Този разтвор се приготвя непосредствено преди употреба.

2.21. Подвижна фаза

Толуен (2.5) : ацетон (2.2) = 20 : 0,5 (V/V).

2.22. Течен парафин (2.7) : n-хексан (2.6) = 1 : 2 (V/V).

3. Апаратура

Стандартно лабораторно оборудване.

3.1. Водна баня, която може да поддържа температура 60 градуса С.

3.2. Хроматографска вана.

3.3. Източник на УВ светлина, 254 и 366 nm.

3.4. Плаки за тънкослойна хроматография Kieselgel 60 - без флуоресцентен индикатор, 20 x 20 cm, дебелина на слоя 0,25 mm, с концентрираща зона 2,5 x 20 cm (Merck 11845 или еквивалентни).

3.5. Микроспринцовка - 10 ml.

3.6. Микроспринцовка - 25 ml.

3.7. Сушилня, която може да поддържа температура 105 градуса С.

3.8. Стъклени епруветки 50 cm3 (ml) със запушалки на винт.

3.9. Филтърна хартия - диаметър 90 mm, Schleicher & Schull, № 5892, бяла лента или еквивалентна.

3.10. Универсална рН-индикаторна хартия - рН 1-11.

3.11. Стъклени шишенца за проби 5 cm3 (ml).

3.12. Ротационен изпарител (Rotavapor или еквивалентен).

3.13. Нагревателна плоча.

4. Процедура

4.1. Приготвяне на пробата

В стъклена епруветка 50 cm3 (ml) (3.8) се претегля около 1 g от пробата. Прибавят се 4 капки 4 M солна киселина (2.8) и 40 cm3 (ml) ацетон (2.2). За силно алкални продукти като тоалетни сапуни е необходимо да се прибавят 20 капки 4 М солна киселина (2.8). Проверява се стойността на рН дали е около 2 с индикаторна хартия (3.10). Епруветката се запушва и се разклаща енергично в продължение на 1 min.

Ако е необходимо да се улесни екстрахирането на консервантите в ацетоновата фаза, сместа се нагрява леко до около 60 градуса С за стопяване на течната фаза.

Разтворът се охлажда до стайна температура и се филтрува през филтърна хартия (3.9) в конична колба.

20 cm3 (ml) от филтрата се прехвърлят в конична колба 200 cm3 (ml), прибавят се 20 cm3 (ml) вода и се разбърква. рН на сместа се довежда до около 10 с 4 М калиева основа (2.9), като за измерване на рН се използва индикаторна хартия (3.10).

Прибавя се 1 g калциев хлорид (2.10) и се разклаща енергично. Филтрува се през филтърна хартия (3.9) в делителна фуния от 250 cm3 (ml), съдържаща 75 cm3 (ml) диетилов етер и се разклаща енергично в продължение на 1 min. Оставя се да се разделят слоевете и водният слой се излива в конична колба 250 cm3 (ml). Етерният слой се отстранява.

Като се използва индикаторна хартия (3.10), рН на водния слой се довежда до около 2 с помощта на 4 М солна киселина (2.8). Прибавят се 10 cm3 (ml) диетилов етер (2.3), колбата се запушва и се разбърква енергично в продължение на 1 min. Оставя се да се разделят слоевете и етерният слой се прехвърля в ротационен изпарител (3.12). Водният слой се изхвърля.

Етерният слой се изпарява почти до сухо и остатъкът се разтваря в 1 cm3 (ml) диетилов етер (2.3). Разтворът се прехвърля в шишенце за проби (3.11).

4.2. Тънкослойна хроматография

За всички стандартни разтвори и от проби, които ще се хроматографират, се нанасят със спринцовка (3.5) по около 3 ml от разтвора на литиев карбонат (2.20) на еднакви разстояния върху стартовата линия на концентриращата зона на плаката за ТСХ (3.4) и тя се изсушава в поток от студен въздух.

Плаката се поставя върху нагревателната плоча (3.13), загрята до 40 градуса С, за да остават петната колкото е възможно по-малки. С микроспринцовка (3.5) точно върху петната от литиев карбонат се нанасят по 10 ml от стандартните разтвори (2.18) и от разтвора на пробата (4.1) върху стартовата линия на плаката.

Накрая се нанасят по около 15 ml от реактива за дериватизация (2.19) (2-бром-2'-ацетонафтон), отново точно върху петната, където са нанесени стандартните разтвори и разтворът на пробата, както и разтворът на литиев карбонат.

Плаката се нагрява в сушилня (3.7) при температура 80 градуса С в продължение на 45 min. След охлаждане плаката се поставя в хроматографската вана (3.2), която предварително е доведена до равновесие за 15 min (без да се прилага облицоване с филтърна хартия) с подвижната фаза (2.21). Плаката престоява, докато фронтът на елуента достигне разстояние 15 cm от стартовата линия (това може да отнеме приблизително 80 min).

Плаката се изсушава в ток от студен въздух и получените петна се разглеждат под УВ светлина (3.3). За засилване на флуоресценцията на бледите петна плаката може да се потопи в сместа течен парафин/n-хексан (2.22).

5. Отчитане на резултатите

Изчислява се Rf-стойността на всяко петно.

Сравнява се Rf-стойността и поведението при УВ облъчване на петната от пробата и петната от стандартните разтвори.

Прави се предварително заключение относно присъствието и идентичността на наличните консерванти. Провежда се ВЕТХ, описана в част Б, или ако се докаже пропионова киселина - газова хроматография, описана в част Б. Сравняват се получените времена на задържане с тези на стандартните разтвори.

Обобщават се резултатите от ТСХ, ВЕТХ или ГХ и на тази база се определя окончателната идентификация на присъстващите в пробата консерванти.

Б. Определяне на бензоена киселина, 4-хидроксибензоена киселина, сорбинова киселина и салицилова киселина

1. Принцип

След подкисляване пробата се екстрахира със смес от етанол и вода. След филтруване консервантите се определят посредством високоефективна течна хроматография (ВЕТХ).

2. Реактиви

2.1. Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а където е необходимо с чистота "за ВЕТХ".

Използваната вода трябва да бъде бидестилирана или с еквивалентна чистота.

2.2. Етанол, абсолютен.

2.3. 4-хидроксибензоена киселина.

2.4. Салицилова киселина.

2.5. Бензоена киселина.

2.6. Сорбинова киселина.

2.7. Натриев ацетат (CH3COONa.3H2O).

2.8. Оцетна киселина (d420 = 1,05 g/cm3 (ml).

2.9. Ацетонитрил.

2.10. Сярна киселина - 2 М.

2.11. Калиев хидроксид - 0,2 М.

2.12. 2-метоксибензоена киселина.

2.13. Смес етанол-вода: смесват се девет обема етанол (2.2) и един обем вода (2.1).

2.14. Разтвор на вътрешен стандарт

Приготвя се разтвор, който съдържа около 1g с точност 0,001 g 2-метоксибензоена киселина (2.12) в 500 cm3 (ml) смес етанол-вода (2.13).

2.15. Подвижна фаза за ВЕТХ.

2.15.1. Ацетатен буфер: към 1 dm3 (l) вода се прибавят 6,35 g натриев ацетат (2.7) и 20,0 cm3 (ml) оцетна киселина (2.8) и се разбърква.

2.15.2. Подвижната фаза се приготвя чрез смесване на 9 обема ацетатен буфер (2.15.1) и един обем ацетонитрил (2.9).

2.16. Основен разтвор на консервантите

Претеглят се с точност 0,001 g около 0,05 g 4-хидроксибензоена киселина (2.3), 0,2 g салицилова киселина (2.4), 0,2 g бензоена киселина (2.5) и 0,05 g сорбинова киселина (2.6) в мерителна колба от 50 cm3 (ml) и се долива до марката със смес етанол-вода (2.13). Разтворът се съхранява в хладилник и е стабилен в продължение на една седмица.

2.17. Стандартни разтвори на консервантите

В серия от мерителни колби от 20 cm3 (ml) се поставят съответно 8,00; 4,00; 2,00; 1,00 и 0,50 cm3 (ml) от основния разтвор (2.16). Във всяка колба се прибавят по 10,00 cm3 (ml) от разтвора на вътрешен стандарт (2.14) и по 0,5 cm3 (ml) 2 М сярна киселина (2.10). Допълва се до марката със смес етанол-вода (2.13). Тези разтвори се приготвят непосредствено преди употреба.

3. Апаратура

Стандартно лабораторно оборудване.

3.1. Водна баня, нагласена на 60 градуса С.

3.2. Високоефективен течен хроматограф с УВ детектор с променлива дължина на вълната и 10 ml дозираща капиляра.

3.3. Аналитична колона

Неръждаема стомана: дължина - 12,5 до 25 cm, вътрешен диаметър - 4,6 mm, пълнеж - Nucleosil 5C18 или еквивалентен.

3.4. Филтърна хартия - диаметър 90 mm, Schleicher & Schull, № 5892, бяла лента или еквивалентна.

3.5. Стъклени епруветки от 50 cm3 (ml) със запушалки на винт.

3.6. Стъклени шишенца за проби от 5 cm3 (ml).

3.7. Парченца карборунд за кипене, размер 2 до 4 mm или еквивалентни.

4. Процедура

4.1. Приготвяне на пробата

4.1.1. Приготвяне на проба без добавяне на вътрешен стандарт

В стъклена епруветка (3.5) 50 cm3 (ml) се претегля 1 g от пробата с точност 0,001 g. С пипета в епруветката се прибавя 1,00 cm3 (ml) 2 М сярна киселина (2.10) и 40 cm3 (ml) смес етанол-вода (2.13). Прибавя се около 1 g карборунд (3.7), епруветката се затваря и се разклаща енергично поне 1 min, докато се получи хомогенна суспензия. За улесняване на екстракцията на консервантите в етанолната фаза епруветката се поставя във водна баня (3.1), нагласена на 60 градуса С, точно за 5 min.

Епруветката незабавно се охлажда със студена вода и екстрактът престоява 1 h при температура 5 градуса С и се филтрува през филтърна хартия (3.4). Около 2 cm3 (ml) от екстракта се прехвърля в шишенце за проби (3.6). Екстрактът се съхранява при 5 градуса С и се анализира чрез ВЕТХ в рамките на 24 h от приготвянето.

4.1.2. Приготвяне на проба с добавяне на вътрешен стандарт

В стъклена епруветка от 50 cm3 (ml) (3.5) се претегля 1 g от пробата с точност 0,001 g. С пипета в епруветката се прибавя 1,00 cm3 (ml) 2 М сярна киселина (2.10) и 30 cm3 (ml) смес етанол-вода (2.13). Прибавя се около 1 g карборунд (3.7) и 10,00 cm3 (ml) разтвор на вътрешен стандарт (2.14), епруветката се затваря и се разклаща енергично поне 1 min, докато се получи хомогенна суспензия. За улесняване на екстракцията на консервантите в етанолната фаза епруветката се поставя във водна баня при 60 градуса С точно за 5 min.

Епруветката незабавно се охлажда със студена вода и екстрактът престоява 1 h при температура 5 градуса С и се филтрува през филтърна хартия (3.4). Около 2 cm3 (ml) от екстракта се прехвърля в шишенце за проби (3.6). Екстрактът се съхранява при 5 градуса С и се анализира чрез ВЕТХ в рамките на 24 h от приготвянето.

4.2. Високоефективна течна хроматография

Подвижна фаза - ацетонитрил/ацетатен буфер (2.15).

Скоростта на подвижната фаза през колоната се нагласява на 2,0 +/- 0,5 cm3 (ml)/min. Детекторът се настройва на 240 nm.

4.2.1. Стандартна крива

В течния хроматограф (3.2) се дозират по 10 ml от всеки от стандартните разтвори на консервантите (2.17). За всеки разтвор се определя отношението между височината на пиковете на изследваните консерванти към височината на пика на вътрешния стандарт, получени от хроматограмите. Построява се графика за всеки консервант, като се нанасят отношенията на височините на пика спрямо съответните концентрации на всеки стандартен разтвор.

Проверява се дали получените зависимости за всеки стандартен разтвор са линейни.

4.2.2. Определяне

В течния хроматограф се дозират 10 ml от екстракта на пробата (4.1.1) и се записва хроматограмата. Дозират се 10 ml от стандартния разтвор на консерванти (2.17) и се записва хроматограмата. Сравняват се получените хроматограми. Ако в хроматограмата на екстракта на пробата (4.1.1) няма пик с приблизително същото време на задържане както това на 2-метоксибензоената киселина (препоръчвания вътрешен стандарт), в течния хроматограф се дозират 10 ml от екстракта на пробата с добавен вътрешен стандарт (4.1.2) и се записва хроматограмата.

Ако на хроматограмата на екстракта от пробата (4.1.1) се наблюдава пречещ пик, който има време на задържане като на 2-метоксибензоената киселина, трябва да се избере друг подходящ вътрешен стандарт. (Ако един от изследваните консерванти отсъства от хроматограмата, този консервант може да бъде използван като вътрешен стандарт.)

Получените хроматограми на стандартния разтвор и на разтвора на пробата трябва да отговарят на следните изисквания:

- Разделянето на пиковете в най-лошо разделената двойка трябва да бъде не по-малко от 0,90 (за дефиниция на коефициента на разделяне виж фиг.1).

Ако не е постигнато необходимото разделяне, трябва да се използва по-ефективна колона или друга по състав подвижна фаза, чийто подбор продължава до задоволяване на изискванията.

- Коефициентът на асиметрия (AS) на всички получени пикове трябва да бъде в интервала от 0,9 до 1,5 (за дефиниция на коефициента на асиметрия виж фиг. 2). Препоръчва се хроматограмата за определяне коефициента на асиметрия да се записва при скорост най-малко 2 cm/min.

- Базовата линия трябва да бъде стабилна.

5. Изчисления

За изчисляване на концентрацията на киселините-консерванти в разтвора на пробата се използват отношенията на височините на пиковете на изследваните консерванти към височината на пика на вътрешния стандарт (2-метоксибензоена киселина) от стандартната крива.

Фиг. 1. Коефициент на разделяне на пиковете

Фиг. 2. Коефициент на асиметрия на пика

Съдържанието на бензоена киселина, 4-хидроксибензоена киселина, сорбинова киселина или салицилова киселина се изчислява в % (M/M) (xi) по формулата:

		100 x 20 x Мx		Мx
xi %(M/M)	=	______________________________	=	______,
		106 x M		500 x M

където:

М е масата на изпитваната проба (4.1.2) в g;

Мx - концентрацията на консерванта в екстракта на пробата (4.1.2), получена от стандартната крива, в mg/cm3 (ml).

6. Повторяемост (виж ISO 5725)

За съдържание на 4-хидроксибензоена киселина 0,40 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надхвърля по абсолютна стойност 0,035 %.

За съдържание на бензоена киселина 0,50 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надхвърля по абсолютна стойност 0,050 %.

За съдържание на салицилова киселина 0,50 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надхвърля по абсолютна стойност 0,045 %.

За съдържание на сорбинова киселина 0,60 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надхвърля по абсолютна стойност 0,035 %.

7. Забележки

7.1. Резултатите от проведения тест за допустими отклонения от методиката показват, че количеството сярна киселина, която се добавя при екстракцията на киселините от пробата, е критично и границите за количеството на обработваната проба трябва да се поддържат в посочения интервал.

7.2. По желание може да се използва подходяща предколона.

В. Определяне на пропионова киселина

1. Област на приложение

Този метод е подходящ за определяне на пропионова киселина с максимална концентрация 2 % (M/M) в козметични продукти.

2. Дефиниция

Концентрацията на пропионова киселина, измерена по този метод, се изразява като % (M/M) от масата на продукта.

3. Принцип

След екстракция на пропионовата киселина от продукта определянето се извършва чрез газова хроматография с използване на 2-метилпропионова киселина като вътрешен стандарт.

4. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "за газова хроматография".

4.1. Етанол - 96 % (V/V).

4.2. Пропионова киселина.

4.3. 2-Метилпропионова киселина.

4.4. Ортофосфорна киселина - 10 % (M/V).

4.5. Стандартен разтвор на пропионова киселина

В мерителна колба 50 cm3 (ml) се претегля около 1,00 g (p) с точност 0,001 g пропионова киселина и се долива до марката с етанол (4.1).

4.6. Разтвор на вътрешен стандарт

В мерителна колба 50 cm3 (ml) се претегля около 1,00 g (Мx) с точност 0,001 g 2-метилпропионова киселина и се долива до марката с етанол (4.1).

5. Апаратура

5.1. Стандартно лабораторно оборудване.

5.2. Газов хроматограф с пламъчно-йонизационен детектор.

5.3. Стъклена епруветка (2 x 15 сm) със запушалка на винт.

5.4. Водна баня, нагласена на 60 градуса С.

5.5. Стъклена спринцовка 10 cm3 (ml) с мембранен филтър (диаметър на порите 0,45 mm).

6. Процедура

6.1. Приготвяне на пробата

6.1.1. Приготвяне на проба без вътрешен стандарт

В стъклена епруветка (5.3) се претегля около 1 g с точност 0,001 g от пробата (M). Прибавят се 0,5 cm3 (ml) фосфорна киселина (4.4) и 9,5 cm3 (ml) етанол (4.1).

Епруветката се затваря и се разклаща енергично. Ако е необходимо, епруветката се поставя на водна баня, нагрята до 60 градуса С (5.4) за 5 min за пълно разтваряне на липидната фаза. Охлажда се бързо на течаща вода. Част от разтвора се филтрува през мембранен филтър (5.5). Филтратът се хроматографира същия ден.

6.1.2. Приготвяне на проба с вътрешен стандарт

В стъклена епруветка (5.3) се претегля 1 g с точност 0,001 g от пробата (M). Прибавят се 0,5 cm3 (ml) фосфорна киселина (4.4), 0,50 cm3 (ml) от разтвора на вътрешен стандарт (4.6) и 9,0 cm3 (ml) етанол (4.1).

Епруветката се затваря и се разклаща енергично. Ако е необходимо, епруветката се поставя на водна баня, нагрята до 60 градуса С (5.4), за 5 min за разтваряне на липидната фаза. Охлажда се бързо на течаща вода. Част от разтвора се филтрува през мембранен филтър (5.5). Филтратът се хроматографира същия ден.

6.2. Условия за газова хроматография

Препоръчват се следните работни условия:

Колона:

тип - неръждаема стомана

дължина - 2 m

диаметър - 1/8 "

пълнеж - 10 % SPTM 1000 (или еквивалентна) + 1 % H3PO4 върху Хромосорб WAW 100 до 120 mesh.

Температура:

инжектор - 200 градуса С

колона - 120 градуса С

детектор - 200 градуса С

газ-носител - азот

скорост на потока - 25 cm3 (ml)/min.

6.3. Хроматография

6.3.1. Стандартна крива

В серия мерителни колби от 20 cm3 (ml) се поставят съответно 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 и 4,00 cm3 (ml) разтвор на пропионова киселина (4.5). Във всяка колба се добавя с пипета 1,00 cm3 (ml) от разтвора на вътрешен стандарт (4.6), доливат се до марката с етанол (4.1) и се разбъркват.

Приготвените по този начин разтвори съдържат Мx mg/cm3 (ml) 2-метилпропионова киселина като вътрешен стандарт (т.е. 1 mg/cm3 (ml) и р/4, р/2, р, 2р и 4р mg/cm3 (ml) пропионова киселина (т.е. 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 и 4,00 mg/cm3 (ml).

Инжектират се по 1 ml от всеки от тези разтвори и се построява стандартна крива, като на абсцисата се нанасят отношенията на масите на пропионовата киселина към 2-метилпропионовата киселина, а по ординатата - отношенията на съответните площи на пиковете им.

За всеки разтвор се правят по три инжектирания и се изчислява средната площ на пиковете.

6.3.2. Определяне

Инжектира се 1 ml от филтрата на пробата 6.1.1. Получената хроматограма се сравнява с тези на стандартните разтвори (6.3.1). Ако пикът има приблизително същото време на задържане както 2-метилпропионовата киселина, се сменя вътрешният стандарт. Ако не се наблюдава пречене, се инжектира 1 ml от филтрата на пробата 6.1.2 и се измерват площите на пика на пропионовата киселина и на пика на вътрешния стандарт.

Правят се три инжектирания за всеки разтвор и се изчислява средната площ на пиковете.

7. Изчисления

7.1. От стандартната крива, получена в 6.3.1, се отчита отношението на масите К, съответстващо на отношението на площите на пиковете, получени в 6.3.2.

7.2. От така полученото отношение на масите се изчислява съдържанието на пропионова киселина (x) в % (M/M), като се използва формулата:

		0,5 x 100 x Мx		Мx
x %(M/M)	=	К _____________	=	К ____ ,
		50 x M		M

където:

К е съотношение, изчислено в 7.1;

Мx - масата на вътрешния стандарт, 4.6, в g;

М - масата на пробата, претеглена в 6.1.2, в g.

Резултатът се закръглява до втория знак.

8. Повторяемост (виж ISO 5725)

За съдържание на пропионова киселина 2 % (M/M) разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава 0,12 %.

ХХХVII. Идентификация и определяне на хидрохинон, хидрохинон монометилов етер, хидрохинон моноетилов етер и хидрохинон монобензилов етер в козметични продукти

А. Идентификация

1. Област на приложение

Методът се отнася за откриване и идентификация на хидрохинон, хидрохинон монометилов етер, хидрохинон моноетилов етер и хидрохинон монобензилов етер (монобензон) в козметични продукти за осветляване на кожата.

2. Принцип

Хидрохинонът и неговите етери се идентифицират чрез тънкослойна хроматография (ТСХ).

3. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.

3.1. Етанол - 96 % (V/V).

3.2. Хлороформ.

3.3. Диетилов етер.

3.4. Подвижна фаза - хлороформ : диетилов етер = 66 : 33 (V/V).

3.5. Амоняк - 25 % (M/M) (d420 = 0,91 g/cm3 (ml).

3.6. Аскорбинова киселина.

3.7. Хидрохинон.

3.8. Хидрохинон монометилов етер.

3.9. Хидрохинон моноетилов етер.

3.10. Хидрохинон монобензилов етер (монобензон).

3.11. Стандартни разтвори

Стандартните разтвори трябва да бъдат приготвени непосредствено преди употреба и са стабилни един ден.

3.11.1. В градуирана епруветка от 10 cm3 (ml) се претеглят 0,05 g хидрохинон (3.7) с точност 0,001 g. Прибавят се 0,250 g аскорбинова киселина (3.6) и 5 cm3 (ml) етанол (3.1). Прибавя се амоняк (3.5), докато рН достигне 10, и се долива до обем 10 cm3 (ml) с етанол (3.1).

3.11.2. В градуирана епруветка от 10 cm3 (ml) се претеглят 0,05 g хидрохинон монометилов етер (3.8) с точност 0,001 g. Прибавят се 0,250 g аскорбинова киселина (3.6) и 5 cm3 (ml) етанол (3.1). Прибавя се амоняк (3.5), докато рН достигне 10, и се долива до обем 10 cm3 (ml) с етанол (3.1).

3.11.3. В градуирана епруветка от 10 cm3 (ml) се претеглят 0,05 g хидрохинон моноетилов етер (3.9) с точност 0,001 g. Прибавят се 0,250 g аскорбинова киселина (3.6) и 5 cm3 (ml) етанол (3.1). Прибавя се амоняк (3.5), докато рН достигне 10, и се долива до обем 10 cm3 (ml) с етанол (3.1).

3.11.4. В градуирана епруветка от 10 cm3 (ml) се претеглят 0,05 g хидрохинон монобензилов етер (3.10) с точност 0,001 g. Прибавят се 0,250 g аскорбинова киселина (3.6) и 5 cm3 (ml) етанол (3.1). Прибавя се амоняк (3.5), докато рН достигне 10, и се долива до обем 10 cm3 (ml) с етанол (3.1).

3.12. Сребърен нитрат.

3.13. 12-Молибденфосфорна киселина.

3.14. Калиев ферицианид хексахидрат.

3.15. Ферихлорид хексахидрат.

3.16. Реактиви за проявяване на петната:

3.16.1. Към 5 % (M/V) воден разтвор на сребърен нитрат (3.12) се прибавя амоняк (3.5), докато образувалата се утайка се разтвори.

Внимание: Разтворът става експлозивно нестабилен при престояване и след употреба трябва да се изхвърли.

3.16.2. 10 % (M/V) разтвор на 12-молибденфосфорна киселина (3.13) в етанол (3.1).

3.16.3. Приготвя се 1 % (M/V) воден разтвор на калиев ферицианид (3.14) и 2 % (M/V) воден разтвор на ферихлорид (3.15). Преди употреба се смесват равни части от двата разтвора.

4. Апаратура

Стандартно лабораторно оборудване.

4.1. Стандартно оборудване за ТСХ.

4.2. Готови плаки за ТСХ - силикагел GHR/UV254; 20 x 20 cm (Machery, Nagel или еквивалентни); дебелина на слоя: 0,25 mm.

4.3. Ултразвукова вана.

4.4. Центрофуга.

4.5. Ултравиолетова лампа - 254 nm.

5. Процедура

5.1. Приготвяне на пробата

В градуирана епруветка от 10 cm3 (ml) се претеглят 3,0 g от пробата с точност 0,001 g. Прибавят се 0,250 g аскорбинова киселина (3.6) и 5 cm3 (ml) етанол (3.1). Прибавя се амоняк (3.5), докато рН достигне 10, и се долива до обем 10 cm3 (ml) с етанол (3.1). Епруветката се затваря със запушалка и се хомогенизира в ултразвукова вана за 10 min. Филтрува се през филтърна хартия или се центрофугира при 3000 rpm.

5.2. Тънкослойна хроматография

5.2.1. Хроматографската вана се насища с подвижна фаза (3.4).

5.2.2. Върху плаката се нанасят по 2 ml от стандартните разтвори (3.11) и 2 ml от разтвора на пробата (5.1). Хроматограмата се развива на тъмно при стайна температура, докато фронтът на разтворителя достигне разстояние 15 cm от стартовата линия.

5.2.3. Плаката се изважда и се изсушава при стайна температура.

5.3. Проявяване на петната

5.3.1. Плаката се разглежда под УВ светлина при 254 nm и се отбелязва разположението на петната.

5.3.2. Плаката се напръсква с един от следните реактиви:

- сребърен нитрат (3.16.1);

- 12-молибденфосфорна киселина (3.16.2); нагрява се до 120 градуса С;

- разтвор на калиев ферицианид и разтвор на ферихлорид (3.16.3).

6. Отчитане на резултатите

Изчислява се Rf-стойността на всяко петно.

Сравняват се петната, получени от разтвора на пробата, с петната на стандартните разтвори по отношение на: техните Rf-стойности, цвета на петната при УВ облъчване и цвета на петната след оцветяване с реактивите за напръскване.

Прилага се ВЕТХ, описана в раздел (Б), и се сравняват времената на задържане на пика (пиковете) на пробата с тези на стандартните разтвори.

Обобщават се резултатите от ТСХ и ВЕТХ, за да се потвърди присъствието на хидрохинон и/или неговите етери.

7. Забележки

При описаните условия се наблюдават следните Rf-стойности:

хидрохинон - 0,32

хидрохинон монометилов етер - 0,53

хидрохинон моноетилов етер - 0,55

хидрохинон монобензилов етер - 0,58

Б. Определяне

1. Област на приложение

Методът се отнася за определяне на хидрохинон, хидрохинон монометилов етер, хидрохинон моноетилов етер и хидрохинон монобензилов етер в козметични продукти за осветляване на кожата.

2. Принцип

Пробата се екстрахира със смес вода/метанол при слабо нагряване до стопяване на всички липидни материали. Всички търсени вещества се определят посредством течна хроматография с обърнати фази и УВ детектор.

3. Реактиви

3.1. Всички реактиви трябва да са с квалификация "за ВЕТХ", а водата - бидестилирана.

3.2. Метанол.

3.3. Хидрохинон.

3.4. Хидрохинон монометилов етер.

3.5. Хидрохинон моноетилов етер.

3.6. Хидрохинон монобензилов етер (монобензон).

3.7. Тетрахидрофуран, "ВЕТХ" чистота.

3.8. Смес вода : метанол = 1:1 (V/V). Смесват се един обем вода с един обем метанол (3.2).

3.9. Подвижна фаза - смес: тетрахидрофуран : вода = 45:55 (V/V). Смесват се 45 обема тетрахидрофуран (3.7) и 55 обема вода.

3.10. Стандартен разтвор

В мерителна колба 50 cm3 (ml) се претеглят с точност 0,001 g 0,06 g хидрохинон (3.3), 0,08 g хидрохинон монометилов етер (3.4), 0,10 g хидрохинон моноетилов етер (3.5) и 0,12 g хидрохинон монобензилов етер (3.6). Разтварят се и се долива до марката с метанол (3.2).

Стандартният разтвор се приготвя чрез разреждане на 10,00 cm3 (ml) от този разтвор до 50,00 cm3 (ml) със смес вода : метанол (3.8). Тези разтвори се приготвят непосредствено преди употреба.

4. Апаратура

Стандартно лабораторно оборудване.

4.1. Водна баня, поддържаща температура 60 градуса С.

4.2. Високоефективен течен хроматограф с УВ детектор с променяща се дължина на вълната и дозатор с 10 ml капиляра.

4.3. Аналитична колона

Хроматографска колона от неръждаема стомана, дължина 250 mm, вътрешен диаметър 4,6 mm, пълнеж Zorbax фенил (химически свързан фенетилсилан върху Zorbax SIL, допълнително дезактивиран (end-capped) с триметилхлорсилан), размер на частиците 6 mm или еквивалентна. Да не се използва предколона, различна от "phenyl guard" или еквивалентна.

4.4. Филтърна хартия, диаметър 90 mm, Schleicher & Schull, бяла лента № 5892, или еквивалентна.

5. Процедура

5.1. Приготвяне на пробата

В мерителна колба 50 cm3 (ml) се претегля 1 g от пробата (M) с точност 0,001 g. Пробата се диспергира в 25 cm3 (ml) смес вода/метанол (3.8). Колбата се запушва и се разклаща енергично до получаване на хомогенна суспензия. Разклаща се поне 1 min. Колбата се поставя във водна баня (4.1) при 60 градуса С за улесняване на екстракцията. Колбата се охлажда и се долива до марката със смес вода/метанол (3.8). Екстрактът се филтрува с филтърна хартия (4.4). ВЕТХ определянето трябва да се извърши в рамките на 24 h от приготвянето на екстракта.

5.2. Високоефективна течна хроматография

5.2.1. Скоростта на подвижната фаза (3.9) се нагласява на 1,0 cm3 (ml)/min, а детекторът се настройва на 295 nm.

5.2.2. Дозират се 10 ml от разтвора на пробата, получен както е описано в 5.1, и се записва хроматограмата. Измерва се площта на пиковете. Извършва се калибриране, както е описано в 5.2.3. Сравняват се хроматограмите, получени за пробата и за стандартния разтвор. Използват се площите на пиковете и коефициентите на детектора (RF), получени съгласно 5.2.3, за изчисляване на концентрациите на анализираните вещества в разтвора на пробата.

5.2.3. Стандартна крива

Инжектират се 10 ml от стандартния разтвор (3.10) и се записва хроматограмата. Инжектира се няколко пъти, докато се получи постоянна площ на пика.

Определя се коефициентът на детектора RFi:

		Pi
Rfi	=	___ ,
		Сi

където:

Pi e площта на пика на хидрохинона, хидрохинон монометиловия етер, хидрохинон моноетиловия етер или хидрохинон монобензиловия етер;

Сi - концентрацията на стандартния разтвор (3.10) на хидрохинона, хидрохинон монометиловия етер, хидрохинон моноетиловия етер или хидрохинон монобензиловия етер в g/50 cm3 (ml).

Получените хроматограми на стандартния разтвор и на разтвора на пробата трябва да отговарят на следните изисквания:

- Разделянето на пиковете в най-лошо разделената двойка трябва да бъде не по-малко от 0,90 (за дефиниция на коефициента на разделяне виж фиг. 1).

Ако не е постигнато необходимото разделяне, трябва да се използва по-ефективна колона или друга по състав подвижна фаза до получаване на добро разделяне.

- Коефициентът на асиметрия (AS) на всички получени пикове трябва да бъде в интервала от 0,9 до 1,5 (за дефиниция на коефициента на асиметрия виж фиг. 2). Препоръчва се хроматограмата за определяне коефициента на асиметрия да се записва при скорост най-малко 2 cm/min.

- Базовата линия трябва да е стабилна.

6. Изчисления

За изчисляване на концентрацията (концентрациите) на анализираното вещество (вещества) в пробата се използват площите на пиковете на анализираните вещества. Концентрацията на анализираното вещество в пробата се изчислява като % (M/M) (xi) по формулата:

		bi x 100
xi %(M/M)	=	_______ ,
		RFi x М

където:

M е масата на пробата в g;

bi - площта на пика на анализираното вещество в пробата.

7. Повторяемост (виж ISO 5725)

7.1. За съдържание на хидрохинон 2,0 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,13 %.

Фиг. 1. Коефициент на разделяне на пиковете

Фиг. 2. Коефициент на асиметрия на пика

7.2. За съдържание на хидрохинон монометилов етер 1,0 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,1 %.

7.3. За съдържание на хидрохинон моноетилов етер 1,0 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,11 %.

7.4. За съдържание на хидрохинон монобензилов етер 1,0 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,11 %.

8. Възпроизводимост (виж ISO 5725)

8.1. За съдържание на хидрохинон 2,0 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба при различни условия (различни лаборатории, различни аналитици, различни апарати и/или различно време) не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,37 %.

8.2. За съдържание на хидрохинон монометилов етер 1,0 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба при различни условия (различни лаборатории, различни аналитици, различни апарати и/или различно време) не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,21 %.

8.3. За съдържание на хидрохинон моноетилов етер 1,0 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба при различни условия (различни лаборатории, различни аналитици, различни апарати и/или различно време) не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,19 %.

8.4. За съдържание на хидрохинон монобензилов етер 1,0 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба при различни условия (различни лаборатории, различни аналитици, различни апарати и/или различно време) не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,11 %.

9. Забележки

9.1. Когато е установено съдържание на хидрохинон значително по-голямо от 2 % и се изисква по-точна оценка на съдържанието му, екстрактът от пробата (5.1) трябва да се разреди до концентрация, която би се получила от проба, съдържаща 2 % хидрохинон, и определянето се повтаря.

(При някои апарати абсорбцията може да бъде извън интервала на линейност на детектора при високи концентрации на хидрохинон.)

9.2. Пречещи фактори

Описаният метод дава възможност за определяне на хидрохинон и негови етери при единично изократично хроматографиране. Използването на "фенил" колона осигурява достатъчно време на задържане на хидрохинона, което не може да се гарантира, когато се използва С18 колона с описаната подвижна фаза.

Освен това този метод е податлив на влиянието на пречещи вещества, като редица парабени. В такива случаи определянето трябва да бъде повторено с използване на различни системи подвижна/неподвижна фаза. Подходящи методи могат да бъдат намерени в публикациите 1 и 2, а именно:

Колона: Zorbax ODS, 4,6 mm x 25 сm, или еквивалентна:

Температура - 36 градуса С

Скорост - 1,5 cm3 (ml)/min

Подвижна фаза:

за хидрохинон - метанол : вода = 5 : 95 (V/V)

за хидрохинон монометилов етер - метанол : вода = 30 : 70 (V/V)

за хидрохинон монобензилов етер - метанол : вода = 80 : 20 (V/V) (M. Herpol-Boremans et M.-O. Masse, Identification et dosage de l'hydroquinone et de ses ethers methylique et benzylique dans les produits cosmetiques pour blanchir la peau. Int. J. Cosmet. Sci. 8-203-214 (1986)).

Колона: Spherisorb S5-ODS, или еквивалентна:

подвижна фаза - вода : метанол = 90 : 10 (V/V)

скорост: 1,5 cm3 (ml)/min

Тези условия са подходящи за хидрохинон (J.Firth and I.Rix, Determination of hydroquinone in skin toning creams, Analyst (1986), 111, p. 129).

ХХХVIII. Идентификация и определяне на 2-феноксиетанол, 1-феноксипропан-2-ол, метил, етил, пропил, бутил и бензил 4-хидроксибензоат в козметичните продукти

А. Идентификация

1. Област на приложение

Методът се отнася до тънкослойно-хроматографска процедура, която в комбинация с методиката за определяне, описана в част Б, позволява идентификацията на 2-феноксиетанол, 1-феноксипропан-2-ол, метил, етил, пропил, бутил и бензил 4-хидроксибензоат в козметичните продукти.

2. Принцип

Консервантите се извличат от подкислена козметична проба с ацетон. След филтруване ацетоновият разтвор се смесва с вода и мастните киселини се утаяват в алкална среда като техни калциеви соли. Алкалната смес (ацетон/вода) се обработва с диетилов етер за отстраняване на липофилните вещества. След подкисляване консервантите се екстрахират с диетилов етер. Аликвотна част от диетилетерния екстракт се накапва върху плака, покрита с тънък слой силикагел. След проявяване плаката се наблюдава под УВ светлина и петната се оцветяват с реактива на Millon.

3. Реактиви

3.1. Общи положения

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.

3.2. Ацетон

3.3. Диетилов етер

3.4. н -Пентан

3.5. Метанол

3.6. Оцетна киселина, ледена

3.7. Солна киселина (HCI), разтвор 4 mol/dm3 (mol/l)

3.8. Калиев хидроксид (КОН), разтвор 4 mol/dm3 (mol/l)

3.9. Калциев дихлорид дихидрат (CaCI2.2H2O)

3.10. Реактив за оцветяване на Millon. Реактивът на Millon (живачен II нитрат) е в наличност в търговската мрежа (Fluka 69820).

3.11. 2-Феноксиетанол

3.12. 1-Феноксипропан-2-ол

3.13. Метил 4-хидроксибензоат (метилпарабен)

3.14. Етил 4-хидроксибензоат (етилпарабен)

3.15. н-Пропил 4-хидроксибензоат (пропилпарабен)

3.16. н-Бутил 4-хидроксибензоат (бутилпарабен)

3.17. Бензил 4-хидроксибензоат (бензилпарабен)

3.18. Стандартни разтвори

За всяко от стандартните вещества (3.11, 3.12, 3.13, 3.14, 3.15, 3.16 и 3.17) се приготвя 0,1 % (М/V) разтвор в метанол.

3.19. Разтворител за проявяване на хроматограмата (подвижна фаза). Смесват се 88 обема n-пентан (3.4) и 12 обема ледена оцетна киселина (3.6).

4. Апаратура

Стандартно лабораторно оборудване и:

4.1. Водна баня с възможност за поддържане на температура 60 градуса С.

4.2. Съд за проявяване на хроматограмата (хроматографска вана).

4.3. Източник на УВ светлина, 254 nm.

4.4. Плаки за тънкослойна хроматография, 20 x 20 cm, покрити с 0,25 mm силикагел 60F254 с концентрирана зона (Merck № 11798, Darmstadt или еквивалентни).

4.5. Пещ с възможност за поддържане на температура 105 градуса С.

4.6. Сешоар за коса със сух въздух.

4.7. Ролка за нанасяне на реактива на Millon с дължина около 10 cm, външен диаметър около 3,5 cm и дебелина на вълнения пласт 2 до 3 mm (виж забележката под т. 5.2).

4.8. Колби стъклени със запушалки и обем 50 cm3 (ml).

4.9. Електрическа плоча с терморегулатор и настройка на температурата около 80 градуса С. За получаване на равномерно разпределение на температурата плочата се покрива с алуминиева пластина с размери 20 x 20 cm и дебелина около 6 mm.

5. Процедура

5.1. Подготовка на пробата

В колба (4.8) се претегля 1 g от пробата с точност 0,001 g. Прибавят се четири капки разтвор на солна киселина (3.7) и 40 cm3 (ml) ацетон. За силно алкалните козметични продукти, като тоалетен сапун, се добавят 20 капки разтвор на солна киселина. Колбата се запушва и съдържанието й се нагрява внимателно до около 60 градуса С, с което се улеснява екстракцията на консервантите в ацетоновата фаза. Разклаща се в продължение на 1 min, рН на разтвора се измерва с индикаторна хартия, коригира се до рН І 3 със солна киселина (3.7), повторно се разклаща 1 min и след охлаждане до стайна температура се филтрува през книжен филтър. От филтрата се пипетират 20 cm3 (ml) и се разреждат с 60 cm3 (ml) вода в конусна колба от 200 cm3 (ml). Разтворът се алкализира с калиев хидроксид (3.8) до рН 10 (по индикаторна хартия), добавя се 1 g калциев дихлорид дихидрат (3.9) и се разклаща енергично. Филтрува се през книжен филтър в делителна фуния от 250 cm3 (ml), съдържаща 75 cm3 (ml) диетилов етер. Фунията се разклаща силно 1 min и след отделяне на фазите водният слой се събира в конусна колба от 200 cm3 (ml). Разтворът се подкислява до рН около 2 с разтвор на солна киселина (3.7) (по индикаторна хартия), добавят се 10 cm3 (ml) диетилов етер и отново се разклаща енергично 1 min. Изчаква се двете фази да се разделят и 2 cm3 (ml) от етерния слой се прехвърлят в епруветка от 5 cm3 (ml) със запушалка.

5.2. Тънкослойна хроматография

Хроматографската плака (4.4) се поставя върху загрятата плоча (4.9) и на стартовата линия в концентрационната зона се нанасят по 10 ml от стандартните разтвори (3.18) и 100 ml от пробата (5.1). Изпаряването на разтворителя се ускорява с въздушна струя. Изсушената хроматографска плака се оставя да се охлади до стайна температура, след което се поставя в хроматографска вана (4.2) със 100 cm3 (ml) подвижна фаза. Хроматографският процес се провежда при стайна температура и продължава, докато фронтът на разтворителя стигне на 15 cm от стартовата линия. Плаката се изважда от ваната, суши се с горещ въздух от сешоар (4.6) и се наблюдава под ултравиолетова светлина (4.3). Местата на петната се отбелязват. За отстраняване на излишната оцетна киселина плаката се нагрява 30 min в сушилня (4.5) при 100 градуса С. Петната на консервантите се оцветяват с реактива на Millon (3.10), който се нанася с ролка (4.7), докато плаката се навлажни равномерно.

Забележка: Петната могат да се оцветят и чрез внимателно накапване на капка от реактива на Millon върху всяко едно петно, маркирано под ултравиолетовата светлина. Естерите на 4-хидроксибензоената киселина се появяват като червени петна, 2-феноксиетанол и 1-феноксипропан-2-ол като жълти, 4-хидроксибензоената киселина, която може да се открие в пробите като консервант или като продукт от разлагането на парабените, се появява под формата на червено петно (виж 7.3 и 7.4).

6. Идентификация

Идентификацията се извършва по Rf-стойностите на петната от пробите с тези на стандартите, както и чрез сравняване на поведението им под ултравиолетова светлина и на цвета им след нанасяне на реактива на Millon. Тези данни дават предварителна информация за идентичността на консервантите. Ако се появят парабени, трябва да се проведе разделяне с високоефективна течна хроматография (ВЕТХ), описана в раздел Б. Получените резултати се комбинират с тези от тънкослойната хроматография за потвърждаване на присъствието на 2-феноксиетанол, 1-феноскипропан-2-ол и парабените.

7. Забележка:

7.1. Реактивът на Millon е токсичен, поради което се прилага чрез една от описаните процедури. Не се препоръчва пръскането.

7.2. Други съединения, съдържащи хидроксилни групи, могат също да се оцветят с реактива на Millon. Таблица с цветовете и Rf-стойностите, получени за някои консерванти, използвайки тънкослойнохроматографската процедура, е публикувана в N. De Kruijf, M.A.H. Rijk, L.A. Pranato - Soetardhi и А. Schouten (1987): Определяне на консерванти в козметични продукти. Тънкослойнохроматографска процедура за идентификацията на консерванти в козметични продукти (J. Chromatography 410, 395-411).

7.3. В следващата таблица са посочени Rf-стойностите за някои консерванти, които могат да се използват ориентировъчно при идентифициране на изследваните проби.

Съединение	100 x Rf	Цвят
4-хидроксибензоена киселина	11	червен
Метилпарабен	12	червен
Етилпарабен	17	червен
Пропилпарабен	21	червен
Бутилпарабен	26	червен
Бензилпарабен	16	червен
2-феноксиетанол	29	жълт
1-феноксипропан-2-ол	50	жълт

7.4. Не се разделят 4-хидроксибензоената киселина и метилпарабенът. Идентификацията на тези съединения трябва да се потвърди чрез метода на високоефективна течна хроматография (ВЕТХ), описан в част Б, и сравняване на времената на задържане, получени от пробата, с тези на стандартите.

Б. Определяне

1. Област на приложение

Методът се отнася за определяне на 2-феноксиетанол, 1-феноскипропан-2-ол, метил 4-хидроксибензоат, етил 4-хидроксибензоат, пропил 4-хидроксибензоат, бутил 4-хидроксибензоат и бензил 4-хидроксибензоат в козметични продукти.

2. Дефиниция

Количествата на консервантите, определени с този метод, се изразяват като % (M/M).

3. Принцип

Пробата се подкислява чрез добавяне на сярна киселина и суспендира в смес от етанол и вода. След леко загряване на сместа за втечняване на липидната фаза и подобряване на количествената екстракция сместа се филтрува. Консервантите във филтрата се определят чрез обратнофазова ВЕТХ. Като вътрешен стандарт се използва 4-хидроксибензоат.

4. Реактиви

4.1. Основни положения

Всички реактиви трябва да са с квалификация "за ВЕТХ", а водата - бидестилирана.

4.2. Етанол, абсолютен

4.3. 2-Феноксиетанол

4.4. 1-Феноксипропан-2-ол

4.5. Метил 4-хидроксибензоат (метилпарабен)

4.6. Етил 4-хидроксибензоат (етилпарабен)

4.7. н-Пропил 4-хидроксибензоат (пропилпарабен)

4.8. Изопропил 4-хидроксибензоат (изопропилпарабен)

4.9. н -Бутил 4-хидроксибензоат (бутилпарабен)

4.10. Бензил 4-хидроксибензоат (бензилпарабен)

4.11. Тетрахидрофуран

4.12. Метанол

4.13. Ацетонитрил

4.14. Сярна киселина (Н2SO4) разтвор 2 mol/dm3 (mol/l)

4.15. Смес етанол/вода. Смесват се 9 обема етанол (4.2) и 1 обем вода.

4.16. Разтвор на вътрешен стандарт. Претеглят се около 0,25 g с точност 0,001 g изопропилпарабен (4.8), прехвърлят се в мерителна колба от 500 cm3 (ml) и след разтваряне се долива до марката със смес етанол/вода (4.15)

4.17. Подвижна фаза: тетрахидрофуран/вода/метанол/ацетонитрил.

Смесват се 5 обема тетрахидрофуран, 60 обема вода, 10 обема метанол и 25 обема ацетонитрил.

4.18. Изходни стандартни разтвори на консервантите. Претеглят с точност 0,001 g 0,2 g 2-феноксиетанол, 0,2 g 1-феноксипропан-2-ол, 0,05 g метилпарабен, 0,05 g етилпарабен, 0,05 g бутилпарабен и 0,025 g бензилпарабен в мерителни колби от 100 cm3 (ml) и разтворите се доливат до марката със смес етанол/вода (4.15).

Разтворите са стабилни до една седмица при съхраняване в хладилник.

4.19. Стандартни разтвори на консервантите. От изходните стандартни разтвори (4.18) се прехвърлят съответно 20 cm3 (ml), 10 cm3 (ml) 5,00 cm3 (ml), 2,00 cm3 (ml) и 1,00 cm3 (ml) в мерителни колби от 50 cm3 (ml). Във всяка колба се прибавят по 10 cm3 (ml) разтвор на вътрешния стандарт (4.16) и 1,0 cm3 (ml) разтвор на сярна киселина (4.14) и се долива до марката със смес етанол/вода (4.15). Разтворите трябва да са приготвени непосредствено преди употреба.

5. Апаратура

Стандартно лабораторно оборудване и:

5.1. Водна баня с възможност за поддържане на температура 60 градуса С +/- 1 градуса С

5.2. Хроматограф за високоефективна течна хроматография с УВ детектор, дължина на вълната 280 nm.

5.3. Аналитична колона от неръждаема стомана 25 cm x 4,6 mm (или 12,5 cm x 4,6 mm), съдържаща Nucleosil 5С18 или еквивалент (виж 10.1).

5.4. Стъклени колби от 100 cm3 (ml) със запушалки.

5.5. Пемза с размери на зърната от 2 mm до 4 mm.

6. Процедура

6.1. Подготовка на пробата

6.1.1. Подготовка на пробата без добавяне на вътрешен стандарт.

Претегля се около 1,0 g от пробата с точност 0,001 g в стъклена колба 100 cm3 (ml) със запушалка (5.4). Добавят се 1,0 cm3 (ml) разтвор на сярна киселина (4.14), 50 cm3 (ml) етанол/водна смес (4.15) и около 1,0 g пемза (5.5). Колбата се запушва и се разклаща силно, докато се получи хомогенна суспензия. За улесняване екстракцията на консервантите в етаноловата фаза колбата се нагрява 5 min на водна баня (5.1) при температура 60 градуса С +/- 1 градуса С. След това се охлажда бързо на течаща студена вода и престоява в хладилник 1 h. Филтрува се през книжен филтър и около 2 cm3 (ml) от филтрата се прехвърлят в епруветка от 5 сm3 (ml) със запушалка. Екстрактът се съхранява в хладилник. ВЕТХ определянето трябва да се извърши до 24 h.

6.1.2. Подготовка на пробата с добавяне на вътрешен стандарт

Претегля се около 1,0 g +/- 0,1 от пробата с точност 0,001 g и се прехвърля в колба 100 cm3 (ml). Добавят се 1,0 cm3 (ml) разтвор на сярна киселина (4.14) и 40 cm3 (ml) смес етанол/вода (4.15), около 1,0 g пемза (5.5) и точно 10,0 cm3 (ml) разтвор на вътрешен стандарт (4.16). Колбата се запушва и се разклаща силно най-малко 1 min, докато се получи хомогенна емулсия. За улесняване екстракцията на консервантите в етаноловата фаза колбата се загрява 5 min на водна баня при температура 60 градуса С +/- 1 градуса С, след което се охлажда бързо на течаща студена вода и престоява в хладилник 1 h. Филтрува се през книжен филтър. Около 2 cm3 (ml) от филтрата се прехвърлят в епруветка от 5 cm3 (ml) със запушалка. Съхранява се в хладилник до провеждане на ВЕТХ определянето.

6.2. Високоефективна течна хроматография (ВЕТХ)

6.2.1. Хроматографски условия:

- Подвижна фаза: тетрахидрофуран/вода/метанол/ацетонитрил (4.17)

- Скорост на потока: 1,5 cm3/min (ml/min)

- Дължина на вълната: 280 nm

6.2.2. Стандартна крива

Инжектират се по 10 ml от стандартните разтвори на консервантите (4.19). От получените хроматограми се определят съотношенията на височината на пиковете на стандартните разтвори на консервантите към височината на пика на вътрешния стандарт. Построява се крива за всеки консервант, свързваща тези съотношения с концентрацията на стандартните разтвори.

6.2.3. Определяне

Инжектират се последователно по 10 ml от разтвора на пробата без вътрешен стандарт (6.1.1) и на един от стандартните разтвори на консерванта (4.19) и получените хроматограми се сравняват. Ако в хроматограмата на пробата (6.1.1) не се появи пик с приблизително същото време на задържане като това на изопропилпарабена (препоръчан като вътрешен стандарт), се инжектират 10 ml разтвор на пробата с вътрешен стандарт (6.1.2). Хроматограмата се изписва и се измерват височините на пиковете. Ако в хроматограмата на пробата се появи пречещ пик, с приблизително същото време на задържане като това на изопропилпарабена, трябва да се избере друг вътрешен стандарт.

Когато пикът на някои от изследваните консерванти не присъства в хроматограмата на пробата, този консервант може да се използва като алтернативен вътрешен стандарт.

Изчисляват се съотношенията на височината на пика на изследваните консерванти към тези на вътрешния стандарт и се проверява дали за стандартните разтвори, използвани в процедурата за калибриране, се получава линейна зависимост.

Получените хроматограми на стандартния разтвор и на разтвора на пробата трябва да отговарят на следните изисквания:

- Разделянето на пиковете (р) на най-лошо разделената двойка трябва да бъде не по-малко от 0,90 (за дефиниция на пиково разделяне виж фиг. 1).

Ако не е постигнато необходимото разделяне, трябва да се използва по-ефективна колона или друга по състав подвижна фаза.

- Коефициентът на асиметрия (As) на всички получени пикове трябва да бъде в интервала от 0,9 до 1,5 (за дефиницията на коефициент на асиметрия виж фиг. 2).

Препоръчва се хроматограмата за определяне коефициента на асиметрия да се записва при скорост най-малко 2 cm/min.

- Базовата линия трябва да е стабилна.

7. Изчисление

Изчисляването на концентрациите на консервантите в разтвора на пробата се извършва по стандартната крива (6.2.2) и съотношенията на височините на пиковете на изследваните консерванти към тази на вътрешния стандарт. Съдържанието на 2-феноксиетанол, 1-феноксипропан-2-ол, метил 4-хидроксибензоат, етил 4-хидроксибензоат, пропил 4-хидроксибензоат, бутил 4-хидроксибензоат и бензил 4-хидроксибензоат (Wi) се изчисляват като % (М/М) по формулата:

		bi
% Wi (M/M)	=	_______ ,
		200 x M

където:

bi е концентрацията на консерванта i в разтвора на пробата, отчетена по стандартната крива, в mg/dm3 (mg/l);

М - масата на изпитваната проба в g.

8. Повторяемост (виж ISO 5725)

Виж 10.5

Фиг. 1. Коефициент на разделяне на пиковете

Фиг. 2. Коефициент на асиметрия на пика

9. Възпроизводимост (виж ISO 5725)

Виж 10.5.

10. Забележки:

10.1. Стационарна фаза

При ВЕТХ определянето на задържането на веществата от пробата зависи в голяма степен от вида, марката и предварителната подготовка на неподвижната фаза. Изборът на колоната, която ще се използва за разделяне на изследваните консерванти, се решава от получените резултати за стандартните разтвори (виж 6.2.3). Други подходящи неподвижни фази за пълнеж на колоната са Hypersil ODS и Zorbax ODS. Препоръчаният състав на подвижната фаза също може да се оптимизира, за да се получи необходимото разделяне.

10.2. Дължина на вълната, при която се извършва определянето.

Проверката за годността на описаната методика показва, че известна промяна в дължината на вълната на определяне може да окаже значителен ефект върху резултата, поради което при провеждане на анализа този параметър внимателно се контролира.

10.3. Пречещи влияния

При посочените условия от пробата се елуират и много други съединения, като консерванти и козметични добавки. Времената на задържане на голям брой консерванти, описани в приложение № 4, са цитирани в N. de Kruijf, M. A. H. Rijk, L. A. Pranato-Soetardhi и A. Schouten. Определяне на консерванти в козметични продукти. II Високоефективна течнохроматографска процедура за идентифициране на консерванти в козметични продукти (J. Chromatography 1989, 469, 317-318).

10.4. За да се избере подходяща аналитична колона, може да се използва подходяща колона гард.

10.5. Методът е изпитан от девет лаборатории участници, всяка от които е анализирала по три проби. Средните стойности от всички лаборатории в % М/М (m) повторяемост (r) и възпроизводимост (R) за трите проби са посочени в таблицата:

	2-	1-	Метил-	Етил-	Пропил-	Бутил-	Бензил-
Проба	фенокси-	фенокси-	парабен	парабен	парабен	парабен	парабен
	етанол	пропан-
		2-ол

Вита-
минов	m 1,124		0,250	0,0628	0,031	0,0906
крем
	r 0,016		0,018	0,0035	0,0028	0,0044
	R 0,176		0,030	0,0068	0,0111	0,0034
Бързо-
почист-
ващ	m 1,196		0,266	0,076
крем
	r 0,040		0,003	0,002
	R 0,147		0,022	0,004
Маса-
жен	m	0,806			0,180	0,148	0,152
крем
	r	0,067			0,034	0,013	0,015
	R	0,112			0,078	0,012	0,016